[發(fā)明專利]表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110349720.5
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102382803A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王華林;王曼麗;干盈盈;鄧菲;胡志紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/866;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 王守仁

1.一種表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒，其特征是在組II核多角體病毒的基因組中表達(dá)AcMNPV?GP64，其中AcMNPV是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒Autographa?californica?multiplenucleopolyhedrovirus的英文縮寫，GP64是AcMNPV的囊膜糖蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒，其特征是通過對野生型棉鈴蟲核多角體病毒Helicoverpa?armigera?single?nucleopolyhedrovirus，簡稱為HearNPV進(jìn)行基因工程遺傳改良后得到，具體改良方法是：在HearNPV?bacmid?HaBacHz8的多角體蛋白基因polh位點，插入：由AcMNPV?p10基因啟動子pP10及冷杉毒蛾核多角體病毒Orgyia?pseudotsugata?multiple?nucleopolyhedrovirus，簡稱為OpMNPV的囊膜糖蛋白基因啟動子pOp166共同啟動的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV?多角體蛋白基因啟動子pAcPolh和HearNPV多角體蛋白基因啟動子pHaPolh共同啟動的HearNPV多角體蛋白基因，由此得到所述的重組病毒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒，其特征是表達(dá)AcMNPV的囊膜糖蛋白基因gp64以及與GP64氨基酸一致性達(dá)到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的gp64衍生基因。

4.一種權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒，其特征是所述AcMNPV?GP64在改良基因組不含有gp64的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。

5.一種表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法，其特征是該方法包括以下步驟：

（1）重組bacmid?HaBac-gp64-polh的構(gòu)建：將含有由AcMNPV?p10基因啟動子pP10及OpMNPV?Op166基因啟動子pOp166共同控制的AcMNPV?gp64基因，以及由AcMNPV?polh基因啟動子pAcPolh和HearNPV?polh基因啟動子pHaPolh共同控制的HearNPV?polh基因的供體質(zhì)粒pFB-Op166-gp64-polh，通過電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，該DH10B感受態(tài)細(xì)胞中含有野生型棉鈴蟲核多角體病毒HearNPV?bacmid?HaBacHz8以及編碼轉(zhuǎn)座酶的helper質(zhì)粒，然后通過轉(zhuǎn)座的方法獲得重組bacmid?HaBac-gp64-polh；?

（2）轉(zhuǎn)染-感染實驗：將HaBac-gp64-polh?DNA以及轉(zhuǎn)染介質(zhì)Lipofectin分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋，充分混勻后轉(zhuǎn)染5?×?10⁵個HzAM1細(xì)胞；轉(zhuǎn)染6天后收集培養(yǎng)物上清，用其感染一批健康的HzAM1細(xì)胞以擴(kuò)增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4?°C避光保存，感染的細(xì)胞樣品存放于-20?°C保存；

（3）病毒多角體的擴(kuò)增：將重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡幼蟲的血淋巴中，置于28??C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸；用Vortex將液化的蟲尸震碎，通過差速離心的方法獲取較純的多角體，對多角體進(jìn)行計數(shù)后保存于4??C備用；

經(jīng)過上述步驟，得到表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒vHaBac-gp64-polh。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟（2）中，是通過將5?μg?HaBac-gp64-polh?DNA以及12?μl?Lipofectin分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋至100?μl，充分混勻后轉(zhuǎn)染5?×?10⁵個HzAM1細(xì)胞。