[發(fā)明專利]甘蔗條紋花葉病毒檢測(cè)用引物及其檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110349616.6
• 申請(qǐng)日: 2011-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN102363819A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文鳳;黃應(yīng)昆;王曉燕;尹興祥;羅志明;尹炯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 陳左

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體的說涉及甘蔗條紋花葉病毒檢測(cè)用引物及其檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)：

甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane?streak?mosaic?virus，SCSMV)是從甘蔗花葉病植株上鑒定出的一種新型病原，屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)一個(gè)新屬——禾本科病毒屬(Poacevirus)，是引起甘蔗花葉病的一種重要致病病原。目前世界上僅有印度、巴基斯坦、美國(guó)、泰國(guó)、斯里蘭卡、越南以及印度尼西亞有過報(bào)道。我國(guó)國(guó)內(nèi)對(duì)該病毒研究不是很多，僅有在廣東某甘蔗基地內(nèi)從引自印度的甘蔗種質(zhì)資源上發(fā)現(xiàn)該病毒的報(bào)道。但是近年來，由于蔗糖產(chǎn)業(yè)科技和生產(chǎn)的發(fā)展與需求，我國(guó)各蔗區(qū)相繼從境外和國(guó)內(nèi)其它蔗區(qū)頻繁引入了大批甘蔗品種及種質(zhì)材料，在對(duì)甘蔗進(jìn)行品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新的同時(shí)，也增加了像甘蔗條紋花葉病毒類危險(xiǎn)性病害擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。如果對(duì)引種的甘蔗種質(zhì)資源未檢疫或檢疫不到位，極有可能造成該病毒在我國(guó)蔗區(qū)內(nèi)擴(kuò)散，給我國(guó)蔗糖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成潛在威脅，因此建立該病毒的快速檢測(cè)方法是阻截此危險(xiǎn)性病毒擴(kuò)散的重要措施。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種甘蔗條紋花葉病毒檢測(cè)用引物及其檢測(cè)方法，用于甘蔗條紋花葉病毒RT-PCR檢測(cè)的引物序列及其檢測(cè)方法能夠滿足需要。?

本發(fā)明通過分析已報(bào)道的甘蔗條紋花葉病毒的CP基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物。所述的引物對(duì)由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表SCSMV-F&SCSMV-R所示。正向引物的核苷酸序列為：SCSMV-F：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′，反向引物的核苷酸序列為：SCSMV-R：5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′，目的條帶大小為938bp。?

本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法以樣品總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)?增的938bp?DNA片段的位置判定結(jié)果。?

RT-PCR擴(kuò)增過程如下：?

RT的反應(yīng)體系為10ul，即在0.2ml的PCR反應(yīng)管里加入2.5ul的滅菌雙蒸水、2.0ul?5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1.0ul?DNTP、反向引物SCSMV-R?0.5ul(20um/ul)、0.5ul?RNA酶抑制劑、0.5ul反轉(zhuǎn)錄酶、3ul總RNA，混勻。反應(yīng)程序?yàn)?5℃10min、42℃60min、98℃5min，結(jié)束后獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。?

PCR反應(yīng)體系25ul，即在0.2ml的PCR反應(yīng)管里加入9.5ul的滅菌雙蒸水，2.0ul?cDNA、正向引物SCSMV-F和反向引物SCSMV-R各0.5ul(20um/ul)、12.5ul的2×PCR?Taq?mix；反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。?

進(jìn)一步，還可以將上述本發(fā)明引物及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。?

本發(fā)明根據(jù)甘蔗條紋花葉病毒的CP基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，用于甘蔗條紋花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)，通過對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化，建立了甘蔗條紋花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)方法，反應(yīng)結(jié)束后即可根據(jù)特異性擴(kuò)增片段的位置判定樣品中是否含有甘蔗條紋花葉病毒。本發(fā)明的檢測(cè)方法，引物特異性好，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單、可用于大量甘蔗樣品的檢測(cè)，為甘蔗引種檢疫和甘蔗條紋花葉病毒在我國(guó)蔗區(qū)的傳播動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了保證。?

附圖說明

圖1是甘蔗條紋花葉病的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，其中M為D2000plus?DNA?ladder，1為SCSMV陽性對(duì)照，2為SCMV陽性對(duì)照、3為SrMV陽性對(duì)照，4為健康植株。?

圖2是本發(fā)明檢測(cè)大量樣品的試驗(yàn)結(jié)果，其中M為D2000plus?DNA?ladder，1-8為田間采集樣品，9為SCSMV陽性對(duì)照，10為健康植株。?

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例子用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。?

實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)和合成?

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的甘蔗條紋花葉病毒基因組序列和外殼蛋白基因的保守序列(登錄號(hào)Y17738)，采用Premier?5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列為：?

SCSMV-F(正向)：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′?

SCSMV-R(反向)：5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′?