[發明專利]一種重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201110349188.7
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102443600A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 孫艷;王丁丁;胡耀華;金嘉怡;蘇曉樸
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/52;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

????本發明涉及基因工程藥物技術領域，具體涉及一種重組人Sonic?hedgehog?N端蛋白的制備方法。

背景技術

SHH（sonic?hedgehog）是高度保守的分泌型細胞因子家族——“音猬”因子家族的成員之一。該家族在早期胚胎發育過程中作為一種關鍵的形態發生素（morphogen），指導腹神經管、前后肢軸、大腦中線、脊髓、下丘腦、牙齒等多個組織系統的成形。SHH具有調控多能干細胞包括間充質干細胞、造血干細胞、神經干細胞等增殖、分化的功能。它可以單獨或聯合應用其它細胞因子（如bFGF）誘導間充質干細胞向骨組織分化，表達骨源性標記核心結合因子a-1（core-binding?factor?a-1）、堿性磷酸酶（alkaline?phosphatase）、骨鈣素（osteocalcin）、成骨相關轉錄因子Osterix及骨唾液酸蛋白Bone?Sialoprotein。SHH還可以在體內修復顱骨損傷，而SHH基因缺失可造成顱底缺損等畸形。SHH是目前應用于骨組織工程的一種重要的細胞因子。SHH蛋白是一種主要表達于內胚層上皮層的分泌性糖蛋白。SHH基因編碼的SHH前體蛋白在內質網中通過自身催化分裂成?SHH-N及?SHH-C?兩部分，其中SHH-N氨基酸序列較為保守，容易與細胞外基質相聯，具有完全的SHH蛋白信號活性，即長、短信號傳遞功能。

劉如石等（小鼠Shh蛋白N端基因的克隆與原核表達，湖南師范大學自然科學學報，2008年6月第31卷第2期：）公開了小鼠Shh-N蛋白的表達，是用小鼠胚胎總RNA經RT-PCR擴增出編碼小鼠Shh基因N端cDNA序列，克隆到大腸桿菌表達載體pQEN3構建重組表達質粒pQEN3-Shh-N。重組質粒轉化大腸桿菌BL21，經1.0mmol/L?IPTG誘導，在SDS-PAGE上檢測到20kDa目的蛋白帶，與Shh?N端蛋白預期大小一致,其蛋白表達量達到了全菌總蛋白的約30%。重組蛋白經Western?blot鑒定結果顯示，在20kDa處出現單一的顯色條帶，說明表達的重組蛋白為ShhN端蛋白。

時紀元（人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表達及其多克隆抗體制備，第二軍醫大學，2007年博士論文）人工合成了SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表達系統。

發明內容

本發明的目的在于根據現有技術中沒有通過融合蛋白途徑制備人SHH-N蛋白的缺陷，提供一種重組可溶性人SHH-N蛋白（簡稱rhSHH-N蛋白）的制備方法。

本研究利用大腸桿菌成功表達具有誘導骨形成活性的rhSHH-N端蛋白，有助于進一步研究和發展相關的骨組織工程技術，具有較好的市場前景。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，步驟如下：

（1）以SEQ?ID?NO:1~2為引物，GenBank登錄號NM_000193.2的序列為模板，進行PCR擴增反應，PCR條件是94℃，5min，94℃，30s，57℃，1min，72℃，30s，35個循環，72℃，10min；

（2）PCR產物與載體pET43.1a(+)用限制性內切酶EcoR?I，Xho?I進行雙酶切，連接構建重組質粒，轉化大腸桿菌，在LB培養基上37℃條件下培養，構建重組hSHH-N基因工程菌；

（3）培養重組hSHH-N基因工程菌，IPTG誘導其產生重組可溶性hSHH-N融合蛋白；

（4）步驟（3）重組hSHH-N基因工程菌進行破碎細胞、分離、收集融合蛋白；

（5）融合蛋白經透析除去咪唑，加入腸激酶，25℃酶切過夜，再經過鎳柱純化，得到初步純化的重組可溶性hSHH-N蛋白；

（6）初步純化的重組可溶性hSHH-N蛋白經過超濾、透析、凍干得到所述重組可溶性hSHH-N蛋白。

作為一種優選方案，步驟（4）所述破碎細胞用的破碎緩沖液為pH值為7.4的50mM磷酸緩沖液，其中含0.5M?NaCl、0.5mg/ml溶菌酶、1mM?PMSF、1mM?MgCl₂，1.7units/ml?Benzonase，其中溶菌酶、1mM?PMSF、1.7units/ml?Benzonase為用時現加。