[發(fā)明專利]一種重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110349188.7 | 申請日： | 2011-11-08 |
| 公開（公告）號： | CN102443600A | 公開（公告）日： | 2012-05-09 |
| 發(fā)明（設計）人： | 孫艷;王丁丁;胡耀華;金嘉怡;蘇曉樸 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東藥學院 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C07K14/52;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102 | 代理人： | 陳衛(wèi) |
| 地址： | 510006 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 重組 可溶性 hshh 蛋白 制備 方法 | ||
1.一種重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，其特征在于步驟如下：
（1）以SEQ?ID?NO:1~2為引物，GenBank登錄號NM_000193.2的序列為模板，進行PCR擴增反應，PCR條件是94℃，5min，94℃，30s，57℃，1min，72℃，30s，35個循環(huán)，72℃，10min；
（2）PCR產(chǎn)物與載體pET43.1a(+)用限制性內(nèi)切酶EcoR?I，Xho?I進行雙酶切，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在LB培養(yǎng)基上37℃條件下培養(yǎng)，構(gòu)建重組hSHH-N基因工程菌；
（3）培養(yǎng)重組hSHH-N基因工程菌，IPTG誘導其產(chǎn)生重組可溶性hSHH-N融合蛋白；
（4）步驟（3）重組hSHH-N基因工程菌進行破碎細胞、分離、收集融合蛋白；
（5）融合蛋白經(jīng)透析除去咪唑，加入腸激酶，25℃酶切過夜，再經(jīng)過鎳柱純化，得到初步純化的重組可溶性hSHH-N蛋白；
（6）初步純化的重組可溶性hSHH-N蛋白經(jīng)過超濾、透析、凍干得到所述重組可溶性hSHH-N蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，其特征在于步驟（4）所述破碎細胞用的破碎緩沖液為pH值為7.4的50mM磷酸緩沖液，其中含0.5M?NaCl、0.5mg/ml溶菌酶、1mM?PMSF、1mM?MgCl2，1.7units/ml?Benzonase，其中溶菌酶、1mM?PMSF、1.7units/ml?Benzonase為用時現(xiàn)加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，其特征在于步驟（5）腸激酶加入量為每200μg?融合蛋白加入4U。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，其特征在于步驟（5）鎳柱純化是采用親和柱層析純化，填料為Ni-NTA樹脂，吸附條件為pH值5.5~8.5之間；洗脫過程中洗脫液pH值在4~6范圍內(nèi)逐漸降低的同時，咪唑濃度在0.02~0.5M范圍內(nèi)逐漸提高或加入?EDTA或者EGTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組可溶性hSHH-N蛋白的制備方法，其特征在于步驟（6）中超濾是采用分子量為10000道爾頓的超濾膜超濾，透析是采用半透膜，透析液含有0.1%（質(zhì)量百分濃度）的醋酸。
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