[發(fā)明專利]鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110347288.6
• 申請日: 2011-11-07
• 公開（公告）號: CN102680699A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝芝勛;羅思思;劉加波;鄧顯文;龐耀珊;謝志勤;謝麗基;范晴;彭宜
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用100K重組蛋白鑒別I群禽腺病毒感染的動物與經(jīng)免疫接種I群禽腺病毒滅活疫苗的動物的間接ELISA方法。

背景技術(shù)

I群禽腺病毒(Fowl?adenovirus?group?I，以下簡稱FAVI)歸于腺病毒科禽腺病毒屬，具有共同的群抗原，基于hexon基因序列，分為5個不同的種(A-E)，基于中和試驗(yàn)結(jié)果，細(xì)分為12個血清型。FAVI在世界范圍內(nèi)普遍存在，宿主較多在雞、鴨、鵝體內(nèi)，可從健康和發(fā)病的家禽中分離出。該病既可經(jīng)排泄物水平傳播，也可經(jīng)卵垂直傳播，污染雞胚。近年來，由FAVI引起的包涵體肝炎、心包積液肝炎綜合征和砂囊糜爛等疾病，對肉雞的生產(chǎn)及種雞的培育帶來一定的威脅，因而引起養(yǎng)殖業(yè)對該病的預(yù)防和控制。FAVI較多的是在體內(nèi)復(fù)制而不發(fā)病，動物感染該病毒后，呈隱性感染，與其他病原共同作用于家禽。FAVI的滅活苗免疫后，如能建立一種區(qū)分FAVI免疫動物和感染動物的間接ELISA方法，對防控、凈化和消滅該病具有至關(guān)重要的作用。

目前，檢測FAVI的血清學(xué)方法主要有瓊脂免疫擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、免疫熒光、對流免疫電泳、間接血凝反應(yīng)和Southern雜交等。這些方法耗時、費(fèi)力，不適合大批量的檢測血清樣品，而且使用的抗原較多為全病毒，存在散毒的危險。

100K是FAVI的非結(jié)構(gòu)蛋白，是FAVI感染后期中含量最豐富的蛋白質(zhì)，能與最新合成的最主要結(jié)構(gòu)蛋白hexon結(jié)合，使后者發(fā)生卷曲并折疊成同源三聚體，同時能使hexon從細(xì)胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核進(jìn)行裝配。100K還能與腺病毒晚期mRNA結(jié)合，以促進(jìn)病毒蛋白的合成，同時抑制宿主蛋白的合成。

本發(fā)明所述100K重組蛋白的間接ELISA鑒別診斷方法建立的基本原理是病毒非結(jié)構(gòu)蛋白只在病毒復(fù)制增殖過程中表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。目前在疫病防制中采用的滅活疫苗，在制備過程中破壞了絕大多數(shù)非結(jié)構(gòu)蛋白，因此用滅活苗免疫動物，理論上動物體內(nèi)就只有結(jié)構(gòu)蛋白抗體而極少有甚至用現(xiàn)有方法檢測不到的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。而動物感染野毒后，病毒在體內(nèi)復(fù)制、增殖的過程中就有非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，因此可以利用非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在與否來區(qū)分感染動物和滅活苗免疫動物。大量研究表明，利用病毒非結(jié)構(gòu)蛋白建立的ELISA方法能區(qū)分感染與滅活苗免疫產(chǎn)生的抗體，如Raue?R等利用牛病毒性腹瀉NS基因建立商品化ELISA試劑盒，以區(qū)分感染和滅活苗免疫產(chǎn)生的抗體；我國臺灣學(xué)者Shu?PY等利用乙型腦炎非結(jié)構(gòu)蛋白NS1建立區(qū)分感染和免疫抗體的間接ELISA方法；Bruderer?U等利用重組蛋白3ABC建立區(qū)分口蹄疫自然感染和疫苗免疫的抗體的ELISA方法；Makkay?AM等利用新城疫NP基因建立區(qū)分自然感染和HN基因亞單位疫苗雞抗體的ELISA方法；LaviadaMD等構(gòu)建非洲馬病NS3基因重組菌，區(qū)分自然感染和滅活苗免疫的方法。但是，目前尚無利用100K重組蛋白鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是針對上述領(lǐng)域中的不足，提供了一種利用100K重組蛋白鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，該方法特異性強(qiáng)，操作簡單，耗時短，成本低，可大批量檢測樣品。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，是以FAVI?100K重組蛋白為包被抗原，雞血清為檢測樣品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgG為酶標(biāo)二抗來檢測I群禽腺病毒感染產(chǎn)生的抗體。

所述包被抗原是經(jīng)如下步驟制備：

(1)FAVI?100K重組蛋白的原核表達(dá)：以FAVI?CELO毒株的DNA為模板，用特異性引物PCR擴(kuò)增100K(GenBank：U46933：23671-24732nt)目的基因，目的基因克隆于pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。根據(jù)氨芐青霉素抗性提取克隆，快速提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定，得到與目的片段分子量一致的片段，判為陽性結(jié)果，命名為100K-pGEX。陽性質(zhì)粒送大連寶生物公司測序，結(jié)果表明FAVI?100K重組蛋白目的基因序列已正確連入pGEX-4T-1，大小為1062bp，推算蛋白質(zhì)分子量為38.9ku，pGEX-4T-1載體本身表達(dá)的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的分子質(zhì)量為25.6ku，因此，F(xiàn)AVI?100K重組蛋白的分子量為64.5ku，100K基因部分序列擴(kuò)增的引物如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3’，插入EcoR?I酶切位點(diǎn)；