[發明專利]鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201110347288.6
• 申請日: 2011-11-07
• 公開（公告）號: CN102680699A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 謝芝勛;羅思思;劉加波;鄧顯文;龐耀珊;謝志勤;謝麗基;范晴;彭宜
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

1.一種鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于：以FAVI?100K重組蛋白為包被抗原，雞血清為檢測樣品，辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG為酶標二抗來檢測I群禽腺病毒感染產生的抗體。

2.根據權利要求1所述的鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于所述包被抗原是經如下步驟制備：

（1）FAVI?100K重組蛋白的原核表達：以FAVI?CELO毒株的?DNA為模板，擴增100K基因前段核苷酸序列GenBank:U46933:23671-24732nt，克隆至pGEX-4T-1原核表達載體中，在大腸桿菌DH5α中表達，100K基因部分序列擴增的引物如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3’，插入EcoR?I酶切位點；

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGC?CCCGAGACGCCATTTAGGTA-3’，插入Not?I酶切位點；

（2）對FAVI?100K重組蛋白反應原性的鑒定；

（3）將鑒定后的FAVI?100K重組蛋白經谷胱甘肽瓊脂糖樹脂吸附、洗滌、洗脫的親和層析方法，獲得純化的100K-pGEX重組蛋白，即包被抗原。

3.根據權利要求1所述的鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于：所述雞血清包括FAVI陰性血清、實驗感染血清和滅活苗免疫血清。

4.根據權利要求1或2或3所述的鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）包被：用包被液將包被抗原稀釋至1~20μg/mL，包被96孔酶標板，每孔100μL，于37℃溫育1h后，置于4℃12~16h，PBST洗板3次，拍干；

（2）封閉：每孔加入封閉液200μL，37℃孵育，封閉1h，?PBST洗板3次，拍干；

（3）與血清結合：加入檢測樣品，100μL/孔，設陰性標準品和陽性標準品為對照，于37℃孵育1h后，?PBST洗板3次，拍干；

（4）與酶標二抗結合：將辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG用稀釋液以1:1000~1:8000倍稀釋，每孔加入100μL，置于37℃孵育1h后，PBST洗板3次，拍干；

（5）顯色：每孔加入100uL底物顯色液，于37℃避光作用10min；

（6）終止：每孔加入50uL終止液，終止反應；

（7）結果判定：在酶標儀讀取450nm波長處吸光值，即OD450值；

計算FAVI陰性血清的OD450平均值X和標準差SD，FAVI陰性血清的X+3SD作為陰陽性臨界值，若檢測樣品OD450值>陰陽性臨界值，判為陽性；若樣品OD450值<陰陽性臨界值，判為陰性。

5.根據權利要求4所述的鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于：

（1）所述包被液為碳酸鹽緩沖液：Na₂CO₃?1.59g，NaHCO_3?2.93g，加蒸餾水定容至1000mL，調pH值到9.6；

（2）?所述PBST為含有0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液：NaCl??8.0g，KCl??0.2g，KH₂PO₄??0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O??2.9g，吐溫-20??500uL，加蒸餾水定容至1000mL，調pH值到7.4；

（3）所述封閉液為5%脫脂奶，即5g脫脂奶用PBST定容至100mL；

（4）所述稀釋液為1%BSA，即1g牛血清白蛋白BSA用PBST定容至100mL；

（5）所述底物顯色液為：TMB緩沖液10mL，TMB溶液0.5?mL，H₂O_2??32uL；

（6）所述終止液為2M?H₂SO₄，即21.7mL濃硫酸緩慢加入178.3mL蒸餾水中。

6.根據權利要求?4所述的鑒別I群禽腺病毒感染的ELISA檢測方法，其特征在于：所述陰性標準品為以SPF雞胚孵育所產2~5日齡雛雞的血清。