[發(fā)明專利]一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110346091.0
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102373252A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設計）人: 龔國利;陳松;李慧
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C08F222/14;C08F220/06;C08J9/26;B01J20/26;B01J20/30;C12R1/645
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發(fā)明屬于埃博霉素B的生產(chǎn)技術領域，涉及一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

背景技術

埃博霉素B(Epothilone?B)是粘細菌纖維堆囊菌(Sorangium?cellulosum)產(chǎn)生的一種聚酮次級代謝產(chǎn)物，它與臨床上廣泛應用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇具有相同的穩(wěn)定微管活性，且對紫杉醇耐藥的腫瘤細胞具有活性。另外埃博霉素來源于微生物代謝產(chǎn)物的特征使其被人們認為是一種比紫杉醇類藥物更具市場前途的抗癌藥物。

埃博霉素的發(fā)現(xiàn)可以追溯到上世紀八十年代德國國家生物技術研究中心(GBF)的微生物學家對土壤中粘細菌的大量研究工作。1987年他們在尋找抗真菌藥物時發(fā)現(xiàn)了一株粘細菌(Sorangium?cellulosum?So?ce90)能產(chǎn)生一類具有微弱抗真菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，命名為Epothilone(埃博霉素)。當時這個化合物并沒有引起研究人員的重視。1995年默克實驗室的研究人員發(fā)現(xiàn)了埃博霉素具有和紫杉醇類似的促微管聚合活性。從此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更簡單的結構，對紫杉醇抗性腫瘤細胞的高活性以及可以通過微生物發(fā)酵制備而迅速成為繼紫杉醇之后發(fā)現(xiàn)的促微管聚合化合物中最令人興奮的研究熱點。目前諾華、施貴寶、默克、羅氏等大型跨國制藥公司都在埃博霉素藥物的臨床研究上投入了大量的人力物力，美國FDA于2007年10月16日批準施貴寶公司的埃博霉素產(chǎn)品(Ixabepilone，BMS-247550，IxempraTM，“伊沙匹隆”)單用或與卡培他濱合用治療對其他化療藥物無效的轉移性或局部晚期乳腺癌。預期未來將有多種埃博霉素藥物上市。

與臨床研究相比，埃博霉素的生產(chǎn)技術遠遠落后。其主要的瓶頸在于發(fā)酵產(chǎn)量低，粘細菌發(fā)酵制備埃博霉素的產(chǎn)量僅在mg/L發(fā)酵液水平。其中有兩個重要原因，第一是埃博霉素對生產(chǎn)菌株的毒性和反饋抑制作用較大程度導致埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量很難提高；第二個導致埃博霉素生產(chǎn)成本高的原因是發(fā)酵結束后產(chǎn)物中存在大量埃博霉素同系物，導致目標產(chǎn)物分離純化成本非常高。如何提高埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本成為目前埃博霉素藥物研發(fā)的一個重要方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于提供一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：

1)按100ml接種1～10mg菌種的比例，將纖維堆囊菌(Sorangium?cellulosum)接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質量100～800倍的特異性吸附埃博霉素B的分子印跡聚合物，在25～35℃下?lián)u床發(fā)酵96～192h；

2)發(fā)酵完成后，分離并收集發(fā)酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印跡聚合物，然后用甲醇多次萃取，將埃博霉素B從分子印跡聚合物中分離出來，分別收集含有埃博霉素B的甲醇和分子印跡聚合物。

所述的發(fā)酵液中含有黃豆粉20～50g/L、玉米淀粉5～10g/L、磷酸二氫鈉1～2g/L、磷酸氫二鈉1～2g/L、MgSO₄·7H₂O?2～5g/L、FeSO₄·7H₂O?0.1～0.5g/L、CaCl₂?2～5g/L、MnCl₂?0.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L，pH為7.2～7.5。

在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加：在發(fā)酵培養(yǎng)的第1～48h每隔30min按每100ml發(fā)酵液加入0.05～0.2g葡萄糖的比例補加，在第48h至發(fā)酵結束每隔10～15min按每100ml發(fā)酵液加入0.1～0.4g葡萄糖的比例補加。

所述的發(fā)酵液中還含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一種，其含量為5～10g/L；

所述的發(fā)酵液中還含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、黃豆粉、KNO₃、NH₄SO₄中的一種作為氮源，氮源的含量為2～8g/L。

所述的分子印跡聚合物的制備為：

按照埃博霉素B：功能單體∶交聯(lián)劑∶引發(fā)劑∶溶劑＝1∶(2～6)∶(20～30)∶(0.6～1)∶(3～20)的摩爾比，將上述反應原料加入到反應容器中，在保護氣氛下超聲振蕩20～30min，在攪拌下通入氮氣20～30min；然后在45～55℃下聚合反應12～24h，再在55～65℃下聚合反應8～12h；聚合反應完成后將反應產(chǎn)物破碎、研磨、過篩后得到粒徑為40～60μm的聚合反應物；