[發明專利]一種適用于PCR擴增的真菌DNA提取方法

無效

• 申請號: 201110345992.8
• 申請日: 2011-10-29
• 公開（公告）號: CN102559656A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 賈愛榮;劉昌衡;孫永軍;張永剛;孟秀梅;張綿松;胡煒;劉新;袁文鵬;夏雪奎
• 申請（專利權）人: 山東好當家海洋發展股份有限公司;山東省科學院生物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種分離、提取、純化DNA的方法，尤其涉及一種適用于PCR擴增的真菌DNA提取方法。

背景技術

隨著分子生物學學科的發展，在真菌的分子生物學研究中，快速高效地提取質量優良的DNA有著重要意義。真菌具有特殊的細胞壁結構，與其他微生物相比，其細胞壁厚，多糖含量高，所以真菌DNA的提取較為困難。目前，常用的真菌DNA提取方法是CTAB法、SDS法及試劑盒法。前兩種方法的主要技術路線是：利用液體或固體培養基培養真菌，收集菌絲，用液氮研磨破碎細胞壁，再利用各提取液提取DNA，經過純化得DNA。通過這些方法一次可提取大量DNA而且質量較好，但以上這些方法有一定的缺點：一是液氮容易凍傷皮膚，一些地方液氮和干冰不容易獲得而受到限制；二是費時，效率不高；三是所用設備和藥品相對較多。試劑盒法提取DNA效率高、質量好、操作簡單，但是成本較高，不適合大規模使用，而且多數只適合小量制備。

另外，現有的真菌DNA提取方法步驟大體相似，主要差別關鍵在于采用何種方法來打破細胞壁。常用的破壁方法主要有冷凍干燥研磨法、玻璃珠機械破壁法、微波法、酶解法和氯化芐法等。通常冷凍干燥研磨法多用液氮來處理，一般是直接在液氮中研磨；玻璃珠機械破壁法則加入硅膠、石英砂、玻璃珠等來幫助破壁；酶解法和氯化芐法是利用酶、氯化芐、尿素來溶解細胞壁。上述的破壁方法或存在著提取速度慢、或存在著步驟繁瑣、或存在著技術要求高的不足。因而，急需探索一種簡便快速、且費用和技術要求均較低的方法，以大量提取真菌DNA用于滿足后續的PCR擴增等常規分子生物學研究的需求。

發明內容

為了克服現有技術中的不足，本發明提供一種快速、簡便、經濟、易行的適合PCR擴增的真菌DNA提取方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種適合PCR擴增的真菌DNA提取方法，包括以下步驟：

a、培養真菌，離心，收集菌絲體；

b、將所得到的菌絲體置于研磨設備中，加入TRIS飽和酚提取液，研磨至糊狀；

c、將所得到的糊狀物轉入離心管中，加氯仿-異戊醇抽提液混勻抽提蛋白，離心，取上清液；

d、將所得到的上清液加無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀物；

e、將所得到的沉淀物采用乙醇洗滌，干燥，溶解，即得。

一種適合PCR擴增的真菌DNA提取方法，其具體步驟如下：

a、采用液體培養法培養真菌約36～72小時，控制轉速為12000～15000r/min，離心5～10min，收集菌絲體；

b、將步驟a所得到濕重為0.2～0.5g的菌絲體置于研缽，加入1ml的TRIS飽和酚提取液，研磨至糊狀；其中，所述的TRIS飽和酚提取液的pH值為8.0；

c、將步驟b所得到的糊狀物轉入微量離心管中，加0.5ml的氯仿-異戊醇抽提液振蕩混勻，抽提蛋白，其中氯仿-異戊醇抽提液的體積比：25∶1；控制轉速為12000～15000r/min，離心5～10min，取上清液；

d、將步驟c所得到的上清液轉入新離心管中，加入2倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置1～2小時，控制轉速為12000～15000r/min，離心5～10min，收集沉淀物；

e、將步驟d所得到的沉淀物采用濃度為70～75％的乙醇漂洗2次后，控制轉速為7500～12000r/min，離心處理3～5min，然后在超凈工作臺中鼓風干燥，加50μl的無菌去離子水溶解，即得。

上述的步驟c中將所得到的糊狀物轉入微量離心管是采用尖端剪除0.5cm的吸頭轉入。

本發明的提取真菌DNA的方法，具有以下優點：

(1)避免了使用液氮，解決了易凍傷皮膚的問題。并便于不易獲得液氮的地方使用；

(2)減少了試劑的使用，無需加入其他幫助破壁的裂解液，無需昂貴的儀器和試劑，經濟高效；

(3)快速簡便，整個提取過程中在1.5-2個小時內即可完成。

(4)該方法提取的DNA質量較好，適合作為PCR擴增的模板。

因此，與其他常用的真菌DNA提取方法相比，本發明的提取真菌DNA的方法具有簡便、高效、快速和廉價的特點，能在短時間內完成對大量樣品的提取。用此方法提取的DNA濃度和純度理想，能滿足后續的PCR擴增等常規分子生物學研究的要求，特別適合于基礎條件一般的實驗室使用。

附圖說明