[發明專利]一種培養胰腺干/祖細胞的方法

無效

• 申請號: 201110344555.4
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102363764A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 韓忠朝;馬鳳霞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明涉及一種細胞的培養方法，尤其是一種高效誘導胰腺干/祖細胞 分化為內分泌細胞的培養方法。

背景技術

組織細胞培養是生物學中最為重要的實驗技術，應用極為廣泛，促進著 眾多前沿科學如分子生物學、基因工程、蛋白質工程等的發展。組織細胞培 養的方式主要分為三類：懸滴培養、單層培養和立體培養。

懸滴培養法：20世紀初由Harrison和Carrel創立單蓋片懸滴培養法，1924 年Maximow改良為雙蓋片懸滴培養法。懸滴培養的優點是細胞生長在近似 于立體的環境中，缺陷是細胞生長的空間狹小、氣體不足和營養成分少， 限制細胞的生長。

單層培養法：從20世紀40年代末期開始，由Dulbecco為首的學者們，改 用人工合成培養基加胎牛血清作為培養液和把細胞接種在培養瓶中培養，能 使細胞生長為單層，而成為單層培養。單層培養具有傳代方便、易于應用各 種方法觀察和進行研究，以至成為世界至今仍普遍應用的經典培養方法。單 層培養的細胞只有長和寬二維結構，失去了原體內時的立體形態，致使細胞 不能充分表達相應基因產物和發生分化。

立體培養法：目前，立體培養尚在完善和發展中。這種方法的優點為： 將細胞培養在特殊容器中，能隨時更新培養液、提供營養物質和排除代謝產 物；為培養細胞提供有與體內相似的支架系統，建成與原體內相似的生存環 境；為培養細胞提供特定促細胞增殖生長和分化因子。

2007年，我國糖尿病的發病率已增加至5％，糖尿病及其并發癥的死亡率 已上升至第三位。隨著胰島移植技術的發展，胰島移植成為徹底治療糖尿病 最有希望的方法。但是，供體胰腺的不足限制了胰島移植的廣泛開展，因此， 迫切需要尋找β細胞的新來源。胰腺干/祖細胞可分化為β細胞，因此胰腺 干/祖細胞的分離、培養和誘導分化將為細胞治療糖尿病提供了基礎。目前， 胰腺干/祖細胞仍缺乏特異的表面標志，研究者正在嘗試尋找。應用特異的 表面標志，流式細胞儀或免疫磁珠分選可以簡單，有效地分離胰腺干/祖細 胞。但是，分離胰腺干/祖細胞后面臨的最大困難是得到的細胞數比較少， 大部分研究者采用常規的培養方法如單層培養或三維培養，誘導其分化為β 細胞的效率低，而且需要大量細胞因子的誘導。

發明內容

為了解決現有胰腺干/祖細胞培養技術中存在的效率低、細胞因子誘導劑 量大、誘導后的β細胞數量少功能低下等缺陷，本發明提供了一種解決方案， 將懸滴培養法和立體培養法相結合并改進，建立了一種培養胰腺干/祖細胞 的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種培養胰腺干/ 祖細胞的方法，包括以下步驟：

(1)將胰腺干/祖細胞接種于微孔培養板中，接種結束后，立即快速將 接種板翻轉，使接種的細胞懸液和培養液的混合物在接種板表面形成吸附于 接種板的向下的懸滴，而不至于導致液體滴落或濺出；

(2)在懸滴狀態下培養至細胞形成細胞球之后，將細胞球轉移至漂浮的 培養膜上繼續培養至形成具有生理學功能的結構。

具體地說，包括以下步驟：

(1)解剖顯微鏡下分離孕12.5-17.5天胚胎小鼠的胰腺，加入終濃度為 250U/ml的膠原酶Ⅳ200μl，37℃孵育30min，加入PRMI-1640完全培養基 終止消化，用1ml注射器反復吹打胚胎胰腺直至無明顯沉淀，100目的濾網 過濾后，制備胰腺細胞的單細胞懸液；

(2)調整細胞懸液的濃度為(1-5)×10³/μl，取細胞懸液接種于底面 積為0.013cm²的微孔培養板中，20-30μl/孔，接種結束后，快速把培養 板反轉，細胞間相互緊密接觸形成一個細胞球；

(3)在倒置的微孔培養板培養18-24h后，在解剖顯微鏡下把細胞球轉 移至漂浮的直徑為25mm的LCR膜上，直徑為35mm的小培養皿中加入2ml PRMI-1640完全培養基，LCR膜漂浮于培養基中，細胞球體在漂浮的LCR膜 上培養六天，胚胎胰腺干細胞逐漸分化為內、外分泌細胞，細胞中含大量的 分泌顆粒，培養7天后，進行免疫組織化學檢測成熟胰腺細胞。

所述PRMI-1640完全培養基中按體積比加入10％胎牛血清，100U/ml青霉 素，100ug/ml鏈霉素，1％非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。