[發明專利]一種培養胰腺干/祖細胞的方法

無效

• 申請號: 201110344555.4
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102363764A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 韓忠朝;馬鳳霞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

1.一種培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將胰腺干/祖細胞接種于微孔培養板中，接種結束后，立即快速將 接種板翻轉，使接種的細胞懸液和培養液的混合物在接種板表面形成吸附于 接種板的向下的懸滴，而不至于導致液體滴落或濺出；

(2)在懸滴狀態下培養至細胞形成細胞球之后，將細胞球轉移至漂浮的 培養膜上繼續培養至形成具有生理學功能的結構。

2.根據權利要求1所述的培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，包 括以下步驟：

(1)解剖顯微鏡下分離孕12.5-17.5天胚胎小鼠的胰腺，加入終濃度為 250U/ml的膠原酶Ⅳ200μl，37℃孵育30min，加入PRMI-1640完全培養基 終止消化，用1ml注射器反復吹打胚胎胰腺直至無明顯沉淀，100目的濾網 過濾后，制備胰腺細胞的單細胞懸液；

(2)調整細胞懸液的濃度為(1-5)×10³/μl，取細胞懸液接種于底面 積為0.013cm²的微孔培養板中，20-30μl/孔，接種結束后，快速把培養 板反轉，細胞間相互緊密接觸形成一個細胞球；

(3)在倒置的微孔培養板培養18-24h后，在解剖顯微鏡下把細胞球轉 移至漂浮的直徑為25mm的LCR膜上，直徑為35mm的小培養皿中加入2ml PRMI-1640完全培養基，LCR膜漂浮于培養基中，細胞球體在漂浮的LCR膜 上培養六天，胚胎胰腺干細胞逐漸分化為內、外分泌細胞，細胞中含大量的 分泌顆粒，培養7天后，進行免疫組織化學檢測成熟胰腺細胞。

3.根據權利要求1所述的培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，所 述PRMI-1640完全培養基中按體積比加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素， 100ug/ml鏈霉素，1％非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。