[發明專利]一種定量檢測土壤中大腸桿菌的方法及其檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201110344298.4
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102337344A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 曹慧;董麗寧;崔中利
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于微生物定量檢測技術領域，具體涉及一種定量檢測土壤中大腸桿菌方法及其檢測試劑盒。

背景技術

隨著我國城鎮化速度的加快，城市向邊緣遷移與擴張，城鄉結合部處在城市發展和鄉村建設區的連接部位，是城市和農村的一個過渡地帶，更是我國城市中糧食和蔬菜等農產品的主要供應區域，因此，城鄉結合部的土壤健康與質量問題事關重大，不容忽視。目前專家學者對土壤質量的研究主要集中于農藥殘留，重金屬污染和有機污染等指標方面，對于土壤中病原微生物這一生物指標關注不多。來自于禽畜糞便和污水灌溉土壤病原微生物可以潛伏在土壤中存在很長一段時間，并能進入蔬菜體內，最終影響人類的身體健康。尤其是目前經常發生的因蔬菜被污染病原菌而導致的食物中毒越來越受到人們的關注，人們才逐漸認識到這一問題的嚴重性。

目前在病原微生物定量檢測方面主要有平板菌落計數法、MPN計數法，免疫學上的方法和以PCR等分子手段為基礎的分子生物學上的方法。其中傳統檢測方法具有很高的權威性，但是在操作上具有耗時耗力麻煩等缺點，而且用于土壤中病原微生物的定量檢測具有一定的復雜性和操作上的難度；隨著現代分子生物學方法的發展，PCR技術因其快速準確而被廣泛應用于食品中病原微生物的定性檢測中，但是PCR方法不能夠很好地區分死菌和活菌，而且在定量檢測中也顯得不足，這就造成結果上的不準確。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，以實現提供方便、高效、快速的檢測出土壤中的大腸桿菌，并有效提高檢測的靈敏度。本發明的另一目的是提供一種上述方法使用的檢測試劑盒。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，包括以下步驟：

（1）取土壤，用無菌水稀釋成5個稀釋度，分別取5個稀釋度的稀釋樣品1ml，控溫30℃，用乳糖膽鹽發酵培養基，搖床震蕩培養24h，得增菌液；

（2）取少量增菌液，隔水煮沸10min，常溫靜置30~40min使其充分復性，12000r/min離心1min，得上清液；

（3）取2.5μL上清液作為PCR擴增模板，進行PCR反應，引物序列為：

phoA-1：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，

phoA-2：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’；

（4）同時擴增PCR產物、陽性對照和陰性對照，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后染色成像，與陽性對照比較，在684bp處出現特異性擴增條帶者為陽性結果，不出現條帶者為陰性結果。

（5）統計陽性和陰性結果個數，查MPN表計算大腸桿菌個數；計算公式：活菌數/每克土=菌數近似值×數量指標第一位數的稀釋度。

步驟（1）中，稀釋成5個稀釋度的具體操作為：取10g土壤加至90ml水中，震蕩搖勻30min，之后取1ml土壤懸液加至9ml生理鹽水，作為10^-2g/mL，再依次進行系列稀釋至10^-3?g/mL、10^-4?g/mL和10^-5?g/mL。

步驟（2）中，取少量增菌液的具體操作為：取增菌液1ml加入到1.5ml離心管中，6000r/min離心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL無菌雙蒸水中，取其中的50μL進行隔水煮沸。

步驟（3）中，PCR反應體系：在25μL反應體系中，10×PCR緩沖液2.5μL，20mmol?/L?Mg²⁺?2.5μL，2.5mmol/L?dNTP?2.0μL，2.0μmol/L引物1.0μL，2U/μL?Taq?DNA聚合酶0.3μL，補水至25μL。

步驟（3）中，PCR反應條件為：94℃預變性7min，94℃變性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30個循環；最后72℃延伸5min。

步驟（4）中，電泳條件為：先以60V電壓出孔，再以100V電壓電泳30min。

一種定量檢測土壤中大腸桿菌的試劑盒，包括試劑供量為1次反應及以上的試劑I和試劑II，

試劑I：用于選擇性增菌培養大腸桿菌的培養基，成分為乳糖膽鹽發酵培養基，配方為：蛋白胨20.0g/L，膽鹽3.0g/L，乳糖5.0g/L，溴甲酚紫0.01g/L，pH7.4±0.1；