[發明專利]一種定量檢測土壤中大腸桿菌的方法及其檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201110344298.4
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102337344A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 曹慧;董麗寧;崔中利
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

1.一種定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）取土壤，用無菌水稀釋成5個稀釋度，分別取5個稀釋度的稀釋樣品1ml，控溫30℃，用乳糖膽鹽發酵培養基，搖床震蕩培養24h，得增菌液；

（2）取少量增菌液，隔水煮沸10min，常溫靜置30~40min使其充分復性，12000r/min離心1min，得上清液；

（3）取2.5μL上清液作為PCR擴增模板，進行PCR擴增反應，引物序列為：

phoA-1：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，

phoA-2：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’；

（4）同時擴增PCR產物、陽性對照和陰性對照，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后染色成像，與陽性對照比較，在684bp處出現特異性擴增條帶者為陽性結果，不出現條帶者為陰性結果；

（5）統計陽性和陰性結果個數，查MPN表計算大腸桿菌個數；計算公式：活菌數/每克土=菌數近似值×數量指標第一位數的稀釋度。

2.根據權利要求1所述的定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于：步驟（1）中，稀釋成5個稀釋度的具體操作為：取10g土壤加至90ml水中，震蕩搖勻30min，之后取1ml土壤懸液加至9ml生理鹽水，作為10^-2g/mL，再依次進行系列稀釋至10^-3?g/mL、10^-4?g/mL和10^-5?g/mL。

3.根據權利要求1所述的定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于：步驟（2）中，取少量增菌液的具體操作為：取增菌液1ml加入到1.5ml離心管中，6000r/min離心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL無菌雙蒸水中，取其中的50μL進行隔水煮沸。

4.根據權利要求1所述的定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于：步驟（3）中，PCR反應體系：在25μL反應體系中，10×PCR緩沖液2.5μL，20mmol?/L?Mg²⁺?2.5μL，2.5mmol/L?dNTP?2.0μL，2.0μmol/L引物1.0μL，2U/μL?Taq?DNA聚合酶0.3μL，補水至25μL。

5.根據權利要求1所述的定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于：步驟（3）中，PCR反應條件為：94℃預變性7min，94℃變性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30個循環；最后72℃延伸5min。

6.根據權利要求1所述的定量檢測土壤中大腸桿菌的方法，其特征在于：步驟（4）中，電泳條件為：先以60V電壓出孔，再以100V電壓電泳30min。

7.一種定量檢測土壤中大腸桿菌的試劑盒，其特征在于：包括試劑供量為1次反應及以上的試劑I和試劑II，

試劑I：用于選擇性增菌培養大腸桿菌的培養基，成分為乳糖膽鹽發酵培養基，配方為：蛋白胨20.0g/L，膽鹽3.0g/L，乳糖5.0g/L，溴甲酚紫0.01g/L，pH7.4±0.1；

試劑II：用于MPN計數法中陽性管數確認的大腸桿菌PCR反應體系，試劑供量為1次反應及以上，試劑包括：10×PCR緩沖液、20mmol?/L?Mg²⁺、2.5mmol/L?dNTP?、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL?Taq?DNA聚合酶和雙蒸水；其中，上游引物為phoA-1引物，序列為：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，下游引物為phoA-2引物，序列為：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’。