[發(fā)明專利]一種同時提取馬尾松針葉總RNA和基因組DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110344210.9
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102363778A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 季孔庶;王曉鋒;何衛(wèi)龍;夏詩寬
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及馬尾松針葉總RNA和基因組DNA同時 提取的方法。

背景技術(shù)

馬尾松是我國南方重要的用材樹種，其常規(guī)育種取得了較大進(jìn)展，但其分子 育種一直進(jìn)展緩慢，開展馬尾松分子水平上的基礎(chǔ)性技術(shù)開發(fā)很有必要。

高效提取植物總RNA和基因組DNA是進(jìn)行Northern印跡、3′-RACE、 5′-RACE以及高質(zhì)量cDNA文庫構(gòu)建和Southern雜交、PCR擴(kuò)增的首要條件。 雖然現(xiàn)在已有各種商品化的試劑盒分離植物總RNA和基因組DNA，但試劑盒只 是針對總RNA或基因組DNA，分開單獨(dú)提取，且價格昂貴，對于富含多糖、多 酚類次生代謝物等植物也難以滿足實(shí)驗(yàn)要求。當(dāng)研究材料少或者珍貴稀有物種材 料時，如果能從材料中同時提取總RNA和基因組DNA，不僅簡化了實(shí)驗(yàn)步驟， 節(jié)省植物材料，又降低實(shí)驗(yàn)成本和縮短時間，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

馬尾松屬于松科松亞屬針葉樹種，體內(nèi)含有十分豐富的多糖多酚類次生代謝 物，嚴(yán)重影響到總RNA和基因組DNA的提取效果。目前雖有對松樹總RNA和 基因組DNA分別進(jìn)行提取的方法研究的一些報道，但針對總RNA和基因組DNA 同時提取的方法相關(guān)研究尚未見報道。因此，建立一種馬尾松針葉總RNA和基 因組DNA同時提取的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種可以同時提取馬尾松針葉總 RNA和基因組DNA的方法。

本發(fā)明提供的同時提取馬尾松針葉總RNA和基因組DNA的方法，包括以 下幾個步驟：

1、總RNA的提取

用液氮研磨馬尾松室內(nèi)組培苗，之后轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的5ml?CTAB緩沖液中；該 緩沖液含有2％(w/v)CTAB、2％(w/v)PVP、100mM?Tris-HCl(pH8.0)、25mM?EDTA、 2M?NaCl、0.5g/L亞精胺，使用前加入2％(v/v)β-巰基乙醇；水浴加熱，用氯仿∶ 異戊醇(24∶1)抽提兩次，LiCl?4℃沉淀過夜，上清轉(zhuǎn)移到新管(記溶液1)； 沉淀用500μl?SDS緩沖液溶解，500μl氯仿∶異戊醇(24∶1[v/v])抽提一次，乙 醇沉淀，干燥后加水溶解。濃度及純度檢測。SDS緩沖液含有1.0M?NaCl、0.5％(w/v) SDS、10mM?Tris-HCl(pH8.0)、1mM?EDTA(pH8.0)；

2、基因組DNA的提取

用5ml異丙醇沉淀第1步中的溶液1，離心后向沉淀中加入500μl?SDS緩沖 液溶解，500μl氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，乙醇沉淀，最后用70％(v/v)酒 精洗滌2次，干燥后加水溶解。濃度及純度檢測。

本發(fā)明采用了不同于其他植物總RNA和基因組DNA提取的方法，即將總 RNA提取和基因組DNA提取結(jié)合起來同時進(jìn)行。避免了分開單獨(dú)進(jìn)行的繁瑣， 提高材料利用的效率。RNA提取中，加了LiCl需要4℃過夜，沉淀時間短，將 影響到RNA的產(chǎn)率。抽提方法也不同于其他植物抽提方法，僅采用氯仿∶異戊 醇(24∶1)抽提，省去了對環(huán)境污染嚴(yán)重的酚。DNA提取中，用RNA沉淀后留 下的上清液提取基因組DNA。LiCl沉淀時間長，DNA中混有的RNA量少，純 度高，相反，LiCl沉淀時間短，DNA中混有較多的RNA，降低其純度。另外， DNA抽提僅用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次即可，避免抽提過程中DNA大量 損失。

因此采用此發(fā)明的同時提取總RNA和基因組DNA的技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：節(jié) 省材料、縮短提取時間、降低實(shí)驗(yàn)成本、提取的效果好、RNA和DNA純度高。

附圖說明

圖1提取的馬尾松針葉總RNA。

圖2提取的馬尾松針葉基因組DNA。

圖3、圖4是總RNA用于RT-PCR擴(kuò)增。

圖5基因組DNA用于SSR擴(kuò)增。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例

1、總RNA提取

(1)取5ml?CTAB提取緩沖液于10ml離心管中，65℃預(yù)熱5-10min，水浴前 加2％的β-巰基乙醇；