[發(fā)明專利]一種改進的大腸桿菌植酸酶HTP6M及其基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110343131.6
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102392002A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳繼文;王海
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;廣州優(yōu)尼科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A23K1/165;A23L1/305
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及提高大腸桿菌植酸酶耐溫性的方法及一種突變改良的耐溫植酸酶HTP6M及其編碼基因和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

植酸酶是一種能水解植酸的酶類。植酸(Phytate，Phytic?acid，IP6)又稱肌醇六磷酸脂，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。植酸分子含有6個磷酸基團，帶有豐富的磷，植酸是飼料中磷的重要貯存形式。植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸。?

磷是動物機體必需礦物元素，單胃動物體內(nèi)缺乏分解植酸的植酸酶。造成飼料中磷的利用率僅有1/3或更低，為了補充有效磷的不足，必須在飼料中添加無機磷酸鹽，常用的為磷酸氫鈣和骨粉。這樣不僅大大增加了飼料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出體外，造成磷源的浪費和嚴重的環(huán)境問題。單胃動物飼料中通過添加植酸酶，可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排出對環(huán)境的污染。?

通過基因工程手段，特別是DNA重組技術(shù)的應(yīng)用，使各種微生物來源的植酸酶大規(guī)模廉價生產(chǎn)和實際應(yīng)用成為可能。現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的植酸酶主要有來源于黑曲霉的真菌植酸酶和來源于大腸桿菌的細菌植酸酶兩種。其中來源于大腸桿菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道穩(wěn)定性等特點。目前主要通過在粉末飼料直接添加或顆粒飼料后噴涂的方法應(yīng)用在飼料行業(yè)。?

在顆粒飼料生產(chǎn)過程中有一個短暫的80-90℃的高溫階段。細菌植酸酶APPA熱穩(wěn)定性較差，其水溶液在70℃下保溫5分鐘剩余酶活性低于30％，直接添加到動物飼料中進行制粒后存留酶活一般低于20％，使APPA植酸酶在顆粒飼料的應(yīng)用受到限制。采用飼料制粒后植酸酶液體噴涂到飼料上的方法不僅增加設(shè)備投入，而且對酶制劑的穩(wěn)定性、飼料中分布均一性都無法很好的保證。因此，利用生物工程手段提高植酸酶熱穩(wěn)定性是目前飼料用植酸酶的研究熱點之一。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明總的目的是通過基因突變的方法對植酸酶氨基酸序列進行改造，使改造后的植酸酶在溫度的耐受性方面更加優(yōu)良。構(gòu)建基因重組克隆，使改造后的植酸酶高效表達，最終達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。?

本發(fā)明是以大腸桿菌植酸酶APPA為模型植酸酶進行突變篩選。來源于大腸桿菌的植酸酶APPA已經(jīng)被克隆并測序(The?complete?Nucleotide?sequence?of?the?Escherichia?coli?gene?appA?reveals?significant?homology?between?pH2.5?Acid?phosphatase?and?glucose-1-phosphatase.Journal?of?Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500)。該基因全長1299bp，(GeneBank號碼：M58708).編碼432個氨基酸(見圖2)。[魏春寶1]N端的22個氨基酸為信號肽，去除信號肽的大腸桿菌植酸酶可以在畢赤酵母細胞分泌表達獲得具有植酸酶活性的成熟蛋白。Ostanin，K.通過基因突變，高效表達APPA植酸酶，提高表達效率400倍，達到400mU/mg蛋白。(Ostanin，K.et?al.Overexpression，Site?Directed?Mutagenesis，and?Mechanism?of?Escherichia?Coli?Acid?Phosphatase.J.Biol.Chem.267：22830-36，1992).姚斌等在中國發(fā)明專利ZL?02137869.X公布了一種大腸桿菌植酸酶APPB，其于來源于大腸桿菌的植酸酶APPA基因有較高同源性，氨基酸序列同源性達到97.9％，有9個氨基酸的差異，分別對應(yīng)APPA的第51，53，101，151，201，251，252，301，302位。如圖2.該植酸酶具有良好的胰蛋白酶穩(wěn)定性。其活性的最適溫度范圍和APPA植酸酶相似，為35-60℃。?

本發(fā)明提供了一種突變改造的植酸酶，它是以來源于大腸桿菌的植酸酶APPA為模型植酸酶，通過對第47、92、136、159、164、237位氨基酸殘基進行取代得到的。本發(fā)明獲得的植酸酶耐溫性較現(xiàn)有技術(shù)中的植酸酶有明顯提高，經(jīng)70℃熱處理后存留酶活在90％以上。在80℃飼料制粒時，存留植酸酶酶活超過80％，?

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述植酸酶序列如SEQID?NO：2所示。?