[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)熒光原位雜交質(zhì)量控制的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110341817.1
• 申請(qǐng)日: 2011-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102433398A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郇聘;張曉軍;趙翠;李富花;相建海
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q3/00
• 分類(lèi)號(hào): C12Q3/00
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光原位雜交技術(shù)，具體的說(shuō)是一種熒光原位雜交過(guò)程的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)

熒光原位雜交(fluorescence?in?situ?hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是利用核酸序列互補(bǔ)的原理，對(duì)形態(tài)固定的染色體、細(xì)胞、組織切片上的目的核酸序列利用熒光分子進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)的一項(xiàng)分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)。FISH實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜，存在諸多環(huán)節(jié)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)處理不好均可能導(dǎo)致最終結(jié)果的失敗。FISH的主要流程包括染色體及探針的制備、雜交、免疫檢測(cè)等幾個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而每個(gè)環(huán)節(jié)又涉及到數(shù)個(gè)步驟，各步驟均有出現(xiàn)問(wèn)題的可能。然而盡管存在如此多可能出現(xiàn)問(wèn)題的環(huán)節(jié)，當(dāng)前FISH技術(shù)尚缺乏相應(yīng)的監(jiān)控措施，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程猶如進(jìn)行黑箱操作，只有最終結(jié)果出來(lái)之后才能知道實(shí)驗(yàn)是否成功。對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的研究者而言，一旦實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果，很難快速的鎖定問(wèn)題所在，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立和維持極為不利。

FISH實(shí)驗(yàn)最常見(jiàn)的陰性結(jié)果是完全觀察不到信號(hào)。諸多原因均可以導(dǎo)致這種情況的出現(xiàn)，而探針標(biāo)記的成功與否及抗體的免疫親和反應(yīng)是否發(fā)生是雜交信號(hào)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。因此，探針標(biāo)記是否成功以及免疫檢測(cè)條件是否合適是兩個(gè)首先應(yīng)當(dāng)考慮的原因。對(duì)于PCR標(biāo)記的探針，其成功與否可以采用探針在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)明顯滯后的方法簡(jiǎn)單的檢測(cè)。然而對(duì)于其他一些方法標(biāo)記的探針，其分子量大小不定或缺乏分子量對(duì)照，如缺口平移法、隨機(jī)引物法以及體外轉(zhuǎn)錄法制備的探針等，則無(wú)法采用這種策略，因此亟需一種可以鑒定是否標(biāo)記成功的方法。此外，抗體作為一種蛋白質(zhì)，有許多環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)問(wèn)題：比如抗體需要在合適的濃度下和合適的緩沖液中發(fā)揮作用，而不同的抗體其最適濃度和最適緩沖液成分并不盡相同；經(jīng)常凍融抗體可能會(huì)引起抗體的失活，甚至有的批次的抗體本身就質(zhì)量不合格，也需要有相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。

近年來(lái)，通過(guò)復(fù)雜的條件優(yōu)化過(guò)程，我們成功地在中國(guó)明對(duì)蝦和櫛孔扇貝中建立了FISH技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)也深深的體會(huì)到FISH技術(shù)的復(fù)雜和繁瑣。為了解決FISH諸多環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制問(wèn)題，我們建立了一種質(zhì)量控制方法，可以對(duì)FISH過(guò)程中的大多數(shù)中間環(huán)節(jié)，包括探針標(biāo)記、雜交條件、抗體質(zhì)量及免疫檢測(cè)條件等進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。應(yīng)用這種監(jiān)控方法，初次進(jìn)行FISH操作的研究者可以快速的鎖定出問(wèn)題的中間環(huán)節(jié)，并進(jìn)行相應(yīng)的糾正，從而快速高效的應(yīng)用FISH技術(shù)。這種監(jiān)控體系的建立，對(duì)FISH技術(shù)在不同物種，尤其是基礎(chǔ)研究缺乏的海洋生物中迅速普及有重要意義。除此之外，這些方法還可以進(jìn)行相應(yīng)的推廣，從而應(yīng)用于其他雜交技術(shù)的質(zhì)量監(jiān)控上，比如Southern/Northern?blot、組織原位雜交(Tissue?in?situ?hybridization)及整裝原位雜交(Whole?amount?in?situ?hybridization)等。

在以往的報(bào)道中，也有類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)技術(shù)被使用。Roche公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上介紹了一種方法，用來(lái)確定探針標(biāo)記的效率，稱(chēng)為Spot?Test(Catalog?No.：11175025910，其是將地高辛標(biāo)記的RNA探針與對(duì)照RNA點(diǎn)到尼龍膜上，再進(jìn)行免疫檢測(cè)。但是這種方法存在其自身的局限性，應(yīng)用范圍較窄。首先，雜交所用的尼龍膜常帶有很強(qiáng)的自發(fā)熒光，熒光抗體產(chǎn)生的信號(hào)被掩蓋而無(wú)法觀測(cè)到，由此導(dǎo)致FISH等采用熒光抗體的實(shí)驗(yàn)無(wú)法采用這種方法檢測(cè)。其次，F(xiàn)ISH等在載玻片上進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗(yàn)，其某些技術(shù)參數(shù)與在膜上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)并不相同，如封閉液的選擇，抗體的濃度，雜交液的用量等等。因此對(duì)于載玻片上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，相關(guān)的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)也最好在玻片上進(jìn)行。最后，上述提到的方法只是簡(jiǎn)單的將抗體和偶聯(lián)到膜上的探針?lè)跤溆猛緝H僅限于探針及免疫檢測(cè)條件的控制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種熒光原位雜交過(guò)程的質(zhì)量控制方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

1.一種熒光原位雜交過(guò)程的質(zhì)量控制方法，其特征在于：載玻片經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理后，設(shè)置不同的DNA樣品區(qū)，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風(fēng)干后經(jīng)紫外交聯(lián)儀照射，使DNA結(jié)合到玻片上，得到簡(jiǎn)化的染色體片，而后進(jìn)行免疫檢測(cè)，通過(guò)不同區(qū)域信號(hào)的反應(yīng)得出熒光原位雜交過(guò)程的質(zhì)量反饋。