[發(fā)明專利]用于檢測EGFR外顯子21多態(tài)性的引物組及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110341761.X
• 申請(qǐng)日: 2011-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN102453764A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 井口亞希
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 愛科來株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方億思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 肖善強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測EGFR外顯子21多態(tài)性的引物組以及所述引物組的應(yīng)用。

背景技術(shù)

已經(jīng)認(rèn)為表皮生長因子受體(EGFR)在肺癌中起重要作用。能夠阻抑(suppress)EGFR功能的藥物已被用于肺癌治療的領(lǐng)域。被用于治療非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)等等)作為此類藥物已知。這些藥物不僅被用于肺癌，也被嘗試用于腺癌。然而，在一些患者組中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果有時(shí)似乎不夠。另外，在另一組患者中，盡管EGFR酪氨酸激酶抑制劑在開始誘導(dǎo)反應(yīng)，但是存在EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果逐漸降低的情況，這與預(yù)期相反。

因?yàn)檫@些原因，已針對(duì)抑制劑的使用研究了預(yù)測EGFR酪氨酸激酶抑制劑效果的因素，并已發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變是此類重要因素。已知的預(yù)測性因素的例子包括EGFR外顯子在密碼子790處的突變(T790M)(JP2008-529532，Cancer?Research，Vol.66，No.16，2006，pp.7854-7858)，外顯子18在密碼子719處的突變(G719X)(Cancer?Research，Vol.66，No.16，2006，pp.7854-7858)。

EGFR外顯子21在密碼子858處由亮氨酸到精氨酸的突變(EGFR外顯子21L858R)已被明確地認(rèn)為能增強(qiáng)吉非替尼的腫瘤減小效應(yīng)。因?yàn)樵诟甙俜直?約45％)的肺癌中發(fā)現(xiàn)了EGFR突變，所以EGFR突變作為在給藥前要考慮的預(yù)測性因素來說是重要的。

直接測序方法(J.Clin.Oncology，Vol?23，No?11(April?10)，2005：pp.2513-2520)或SMAP(SMart-Abplification?Process)方法(Clin?Cancer?Res2007；Vol.13(17)September?1，2007：pp.4974-4983)已知是檢測EGFR外顯子21L858R的技術(shù)。

同時(shí)，突變檢測方法已知是容易、靈敏并且可靠的檢測突變的方法，該方法包括，通過在一個(gè)反應(yīng)中既使用突變型又使用野生型(正常型)引物，來優(yōu)先擴(kuò)增具有突變的堿基的核酸序列(WO?2010/001969)。

發(fā)明內(nèi)容

實(shí)際測試中使用的樣品是來自血漿或血清的可溶的DNA。在此類DNA中檢測突變需要高特異性。然而，在直接測序方法中，特異性通常被認(rèn)為是約10％，這可能不足以檢測可溶DNA中的突變。同時(shí)，盡管SMAP方法在靈敏度的角度來看可能是足夠的，但是對(duì)材料(例如引物)的設(shè)計(jì)可能不容易，實(shí)際的操作可能是復(fù)雜的。

考慮這些情況進(jìn)行了本發(fā)明。本發(fā)明涉及提供下述探針以及所述探針的應(yīng)用，所述探針能夠以高靈敏度容易地檢測EGFR外顯子21多態(tài)性的探針。

本發(fā)明第一方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[1]：用于檢測EGFR外顯子21中多態(tài)性的引物組，所述引物組包含P1寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能夠通過使用SEQ?ID?NO：1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述區(qū)域包含SEQ?ID?NO：1的第172792個(gè)堿基，

P1寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ?ID?NO：1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，

P2寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ?ID?NO：1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，和

P1寡核苷酸和P2寡核苷酸滿足下述相關(guān)性中的至少一種：P1寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度；或P1寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個(gè)或多個(gè)堿基。

本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[2]：[1]的引物組，其中P1寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ?ID?NO：1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含至少一個(gè)與SEQ?ID?NO：1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。

本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[3]：[1]或[2]的引物組，其中P1寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ?ID?NO：1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含額外的序列，所述額外的序列由連續(xù)的2到10個(gè)與SEQ?ID?NO：1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基形成，并且位于所述寡核苷酸鏈的5′末端。