[發明專利]一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法

無效

• 申請號: 201110341755.4
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102363766A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 張西鋒;李蘭;張志鵬;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

技術領域：

本發明涉及一種ActA(Activin?A，激活素A)促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法，特別是涉及一種在體外培養卵母細胞時，在培養基中加入ActA，促進未成熟卵母細胞成熟的方法。屬于生殖醫學的生物醫學技術領域。?

背景技術：

哺乳動物卵巢中含有各個不同發育階段的大量卵泡。最大的一部分是原始卵泡。然而，雌性具有繁殖力的時期，只有一小部分卵泡生產出具有排卵能力并成熟的卵母細胞。剩余的卵巢卵泡(＞99.9％)最后閉鎖。為了獲得額外的雌性配子資源，致力于發展在卵泡早期發育階段生產完全生長的具有發育能力的卵母細胞技術具有很大的意義。早期卵泡的體外發育研究對調節原始卵泡到初級卵泡的轉變機制的研究是很重要的并具有臨床意義，并且可以應用于輔助生殖技術體外培養原始卵泡來生產成熟卵母細胞，用以生產有價值的家畜和瀕危滅絕的野生品種。?

卵泡體外培養技術的建立可應用于生物學和醫學等領域，可以用來彌補卵母細胞在保存過程中由于損傷導致的受精能力的喪失缺憾(環境因素、放療、化療)；為患癌癥的年輕女性在癌癥治療時保存她們的生育能力帶來新的希望；并為治療性克隆和卵巢不孕癥病人提供優質的卵母細胞，創造巨大的社會和經濟價值。?

發明內容：

本發明的目的在于提供一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法，該方法通過在卵母細胞和顆粒細胞的共培養時，在培養基中加入ActA來促進未成熟卵母細胞的體外成熟，為開發卵母細胞資源應用于生物醫學提供了很好的技術手段。?

為了實現上述發明目的，本發明的一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法，收集腔前顆粒細胞放入提前備好的生長液滴中，在培養箱中過夜培養，做成顆粒細胞層；將收集的55～65μm之間的卵母細胞放入培養24h后的顆粒細胞層上，在培養基中添加濃度為100ng/ml的ActA共培養，實現未成熟卵母細胞的體外成熟。?

本發明方法包括下列具體操作步驟：?

第一步、腔前顆粒細胞的收集和培養：?

用出生后12～14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及顆粒細胞，收集顆粒細胞放入備好的生長液滴中培養24小時，培養條件是每個液滴100μl，37℃，5％CO₂、飽?和濕度的培養箱里，制成顆粒細胞層；?

所述消化酶是含有0.25％胰酶，0.2％膠原酶IV和0.02％DNAse-I(DNA消化酶I，購自sigma公司)的消化酶。?

所述生長液的配制：α-MEM(密理博高糖培養基，HyClone公司)；BSA(牛血清白蛋白，Roche公司)3mg/ml；脂肪酸(Fetuin)1mg/ml；1％ITS-mix(胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物，HyClone公司)；FSH(促卵泡素，HyClone公司)10mIU/ml；EGF(表皮生長因子，HyClone公司)5ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素。?

第二步、12～14dpp卵母細胞的收集和培養：?

機械法分離出生后12～14天小鼠卵巢后，體視鏡下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母細胞，然后挑出直徑在55～65μm之間的卵母細胞，在生長培養液中培養，培養條件是37℃，5％CO₂、飽和濕度的培養箱里，每隔2天換半液；以每個液滴20個卵母細胞放入培養24h后的顆粒細胞層上培養，在培養基中添加濃度為100ng/ml的ActA；?

所述消化酶是含有0.25％胰酶，0.2％膠原酶IV和0.02％DNAse-I的消化酶。?

卵母細胞生長培養液的配制：α-MEM；10％FCS(胎牛血清)；1％ITS-mix；FSH?10mIU/ml；EGF?5ng/ml；ActA?100ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素。?

第三步、卵母細胞的成熟培養：?

卵母細胞培養7天后，挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前備好的培養液滴中(6cm培養皿，每個液滴100μl，37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養箱里培養過夜)，在37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養箱里培養18h，統計卵母細胞成熟的比例。?

成熟培養液的配制：α-MEM；BSA?3mg/ml；Fetuin?1mg/ml；1％ITS-mix；FSH?100mIU/ml；EGF?1ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素。?