[發(fā)明專利]一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110341755.4
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102363766A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張西鋒;李蘭;張志鵬;沈偉
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務(wù)所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

1.一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于按照如下步驟操作：第一步、腔前顆粒細胞的收集和培養(yǎng)：用出生后12～14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及顆粒細胞，收集顆粒細胞放入備好的生長液滴中培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)條件是每個液滴100μl，37℃，5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱里，制成顆粒細胞層；第二步、12～14dpp卵母細胞的收集和培養(yǎng)：機械法分離出生后12～14天小鼠卵巢后，體視鏡下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母細胞，然后挑出直徑在55～65μm之間的卵母細胞，在生長培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃，5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱里，每隔2天換半液；以每個液滴20個卵母細胞放入培養(yǎng)24h后的顆粒細胞層上培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加濃度為100ng/ml的ActA；第三步、卵母細胞的成熟培養(yǎng)：卵母細胞培養(yǎng)7天后，挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前備好的培養(yǎng)液滴中，6cm培養(yǎng)皿，每個液滴100μl，37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜，在37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h，統(tǒng)計卵母細胞成熟的比例；其中，第一步中生長液的配制：密理博高糖培養(yǎng)基；牛血清白蛋白3mg/ml；脂肪酸1mg/ml；1％胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素10mIU/ml；表皮生長因子5ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素；第二步中卵母細胞生長培養(yǎng)液的配制：密理博高糖培養(yǎng)基；10％胎牛血清；1％胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素10mIU/ml；表皮生長因子5ng/ml；ActA?100ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素；第三步中成熟培養(yǎng)液的配制：密理博高糖培養(yǎng)基；牛血清白蛋白3mg/ml；脂肪酸1mg/ml；1％胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素100mIU/ml；表皮生長因子1ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青霉素和鏈霉素。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種ActA促進未成熟卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于所述消化酶含有0.25％胰酶，0.2％膠原酶IV和0.02％DNA消化酶I。?