[發明專利]ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法

無效

• 申請號: 201110341752.0
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102363765A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 張西鋒;李蘭;張志鵬;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

技術領域：

本發明涉及一種激活素A(ActA)促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，特別是涉及一種將12.5dpc(交配后的天數)減數分裂前的生殖細胞利用體外培養的方法分化發育成生發泡(GV)期卵母細胞并誘導成熟，利用體外受精技術檢測體外發育形成的卵母細胞質量，獲得早期發育的體外受精后代的方法。屬于生殖醫學的生物醫學技術領域。?

背景技術：

在先前的研究中，來源于小鼠減數分裂前的生殖細胞不能恢復減數分裂并發育到MII期。在雌性小鼠胚胎中，13.5dpc生殖細胞經歷了進一步的DNA復制，并且進入第一次減數分裂的前期。然而，來源于胎兒生殖細胞的卵母細胞體外生長僅僅能進入到第一次減數分裂的雙線期，并停滯在這一時期。研究人員發現，小鼠11.5～12.5dpc的生殖嵴分離獲得的PGCs在沒有體細胞的支持下不能存活，而是快速的凋亡，而利用小鼠胎兒肺細胞與生殖細胞聚合后體外培養，生殖細胞可以像在卵巢里的發育進程一樣進入第一次減數分裂。如果進入雌性生殖嵴的生殖細胞數量過少，顆粒細胞的分化可以被啟動，但是很快就失去了分化能力，卵母細胞也隨后死亡或數量減少。卵母細胞與顆粒細胞間的的互作是雙向的，這種互作調控了這兩種類型細胞的發育，它不僅是卵母細胞發育必需的，也是卵泡發育所必需的，從原始卵泡的形成到成熟卵泡的排卵始終都有互作的存在。最近，科學家建立了一種生殖細胞與體細胞的共培養方法，并結合KITL、bFGF和LIF等因子的作用，可以使從雌性胎鼠生殖嵴中分離出來的PGC體外發育到卵母細胞第一次減數分裂的雙線期，但這種卵母細胞不能成熟和受精。?

Obata和Niwa等利用12.5dpc胎鼠完整的卵巢進行體外培養28d，但獲得的卵母細胞不能完成第二次減數分裂。可能是多種因素制約了卵母細胞的體外發生。一種原因可能是卵母細胞核、質發育不同步，而核質同步發育成熟又是卵母細胞恢復減數分裂成熟必需的。另一方面，卵泡顆粒細胞與卵母細胞間的間隙連接也影響著卵母細胞的發育，間隙連接形成不完全會阻礙卵母細胞的減數分裂恢復。還有一種原因就是體外發育的卵母細胞不能達到最大直徑的80％，而這是卵母細胞成熟發育所需的。利用生殖細胞體外培養的方法難以克服這些問題，因為至今對卵母細胞生長、卵泡內顆粒細胞與卵母細胞間隙連接的形成、卵母細胞的減數分裂啟動等調控機理知之甚少。?

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法。?

為了實現上述發明目的，本發明利用機械法分離12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，體外培養胎鼠生殖嵴后收集卵母細胞，將12.5dpc減數分裂前的生殖細胞利用體外培養的方法分化發育成GV期卵母細胞并誘導成熟，得到成熟的卵母細胞；并利用體外受精技術檢測體外發育形成的卵母細胞質量，可獲得早期發育的體外受精后代。?

所述胎鼠生殖嵴的分離按照如下步驟操作：胎鼠卵巢來源于12.5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以見栓為0.5dpc。出生后小鼠的卵巢來源于12～14dpp的小鼠。利用機械分離法從胎鼠體內分離出卵巢，并轉移到磷酸鹽緩沖液(PBS)+10％FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術鑷子去掉與卵巢連接在一起的中腎組織，在新鮮培養液(密理博高糖培養基(α-MEM)；5％胎牛血清(FCS)；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；10mIU促卵泡素(FSH))中將卵巢洗3次。?

所述胎鼠生殖嵴的體外培養按照如下步驟操作：生殖嵴分離出來培養的當天定為0天。分離出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，一分為二，并在培養液中貼壁培養28天。組織在37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養箱里培養，培養液每兩天換半液，換液時觀察卵母細胞的發育情況等。此處所用的培養基分為兩種培養液，培養液的配方如下：?

培養液：培養液A包含密理博高糖培養基(α-MEM)；10％胎牛血清(FCS)；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；10mIU促卵泡素(FSH)；100ng/ml激活素A(ActA)；培養液B包含α-MEM；5％FCS；1％胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物(ITS-mix)；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；100mIU/ml?FSH；1ng/ml上皮生長因子(EGF)；100ng/ml?ActA。?