[發明專利]ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法

無效

• 申請號: 201110341752.0
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102363765A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 張西鋒;李蘭;張志鵬;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

1.一種ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，其特征在于利用機械法分離12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，體外培養胎鼠生殖嵴后收集卵母細胞，將12.5dpc減數分裂前的生殖細胞利用體外培養的方法分化發育成生發泡期卵母細胞并誘導成熟，得到成熟的卵母細胞；并利用體外受精技術檢測體外發育形成的卵母細胞質量，獲得早期發育的體外受精后代。

2.根據權利要求1所述的ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的分離按照如下步驟操作：胎鼠卵巢來源于12.5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以見栓為0.5dpc，出生后小鼠的卵巢來源于12～14dpp的小鼠，利用機械分離法從胎鼠體內分離出卵巢，并轉移到磷酸鹽緩沖液+10％胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術鑷子去掉與卵巢連接在一起的中腎組織，在由密理博高糖培養基；5％胎牛血清；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；10mIU促卵泡素配制成的新鮮培養液中將卵巢洗3次。

3.根據權利要求1所述的ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的體外培養按照如下步驟操作：生殖嵴分離出來培養的當天定為0天，分離出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，一分為二，并在培養液中貼壁培養28天，組織在37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養箱里培養，培養液每兩天換半液，培養液A包含密理博高糖培養基；10％胎牛血清；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；10mIU促卵泡素；100ng/ml?ActA；培養液B包含密理博高糖培養基；5％胎牛血清；1％胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；100mIU/ml促卵泡素；1ng/ml上皮生長因子；100ng/ml?ActA。

4.根據權利要求1所述的ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，其特征在于卵母細胞的收集按照如下步驟操作：收集添加ActA體外培養到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的組織塊，0.25％胰酶，0.2％膠原酶IV和0.02％?DNAse-I消化，37℃處理10min，加入膠原酶等體積的胎牛血清終止消化，洗滌3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸鹽緩沖液中反復洗滌，直至收集的樣品中不再含有顆粒細胞。

5.根據權利要求1所述的ActA促進減數分裂前雌性生殖細胞體外發育的技術方法，其特征在于卵母細胞的培養及成熟誘導按照如下步驟操作：使用口吸管吸出卵母細胞，然后挑出直徑在75μm以上的卵母細胞，每個液滴20個卵母細胞放入培養24h后的顆粒細胞層上，12～14dpp腔前卵泡顆粒細胞收集后放入提前做好的培養液滴中，培養液配方：密理博高糖培養基；10％胎牛血清；1％胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素10mIU/ml；上皮生長因子5ng/ml；ActA?100ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素；6cm培養皿，每個液滴100μl，37℃，5％CO₂、飽和濕度的培養箱里培養過夜；共培養7天后，取出卵母細胞，?挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前做好的成熟培養液培養滴中，6cm培養皿，每個液滴100μl，37℃，5％CO₂、飽和濕度的培養箱里培養過夜，在37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養箱里培養18小時，統計卵母細胞成熟的比例；成熟培養液的配方為：密理博高糖培養基；10％胎牛血清；1％胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素100mIU/ml；上皮生長因子1ng/ml；1％丙酮酸鈉；1％青鏈霉素。?