[發(fā)明專利]一種快速提取懸鉤子屬植物總RNA的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201110341215.6
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102329792A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯浩茹;陳清;劉澤靜;王小蓉;余昊唯;賈慧峰
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速提取懸鉤子屬植物總RNA的方法

(二)背景技術(shù)

獲得高質(zhì)量總RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究如基因表達(dá)水平研究、基因操作如RNA干擾、轉(zhuǎn)基因等下游研究的前提條件。懸鉤子屬植物的樹莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚類次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)給總RNA提取帶來了重重困難：酚類化合物極易被氧化成褐色物質(zhì)，然后與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失，或形成不溶復(fù)合物導(dǎo)致在用氯仿抽提時(shí)RNA的大量丟失。

商業(yè)試劑盒，比如Trizol試劑盒在應(yīng)對該類植物總RNA提取時(shí)顯得無能為力，而傳統(tǒng)的總RNA提取方法如CTAB、SDS等需要較多的植物材料，且需要使用多步抽提來去除多糖、蛋白和基因組DNA。目前使用最多的方法是在植物細(xì)胞破碎后，使用LiCl進(jìn)行RNA的選擇性沉淀，達(dá)到去除基因組DNA或多糖的目的。但該方法最大的缺點(diǎn)是耗時(shí)太長，一般都選擇沉淀過夜。若改成醇沉淀，DNA污染特別嚴(yán)重，需要進(jìn)一步使用DNase處理，然后經(jīng)過酚-氯仿抽提以滅活DNase，結(jié)果造成RNA的大量損失。另外，LiCl沉淀后的洗脫過程要求嚴(yán)格，因?yàn)闅埩舻腖i⁺，Cl^-會對后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增產(chǎn)生負(fù)面的影響。

所以我們迫切需要一種更方便快捷，而且能有效去除多糖、多酚以及基因組DNA等物質(zhì)的RNA提取方法。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明創(chuàng)造了一種適用于懸鉤子屬植物的簡單、快速的總RNA提取方法。該方法的特征在于按以下步驟執(zhí)行：

1)取離心管，向離心管中加入700～1000μl去糖緩沖液，并加入5～15μl?β-巰基乙醇，于-20℃預(yù)冷5～10min；

2)取新鮮植物材料或經(jīng)液氮速凍后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移至步驟1)的離心管中，溫柔上下顛倒混勻后于冰上靜置10min；

3)在4℃下按照3200×g離心5～10min；

4)徹底去除步驟3)離心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl?65℃預(yù)熱的細(xì)胞裂解液，渦旋1min，于55～65℃保溫20～30min；

5)待步驟4)中的混合液冷卻至室溫后，按順序加入細(xì)胞裂解液等體積的水飽和酚，1/80-1/50裂解液體積的pH調(diào)節(jié)劑，1/5裂解緩沖液體積的氯仿，劇烈震蕩2min；

6)在4℃下按照16000×g離心5～10min；

7)將步驟6)離心所得上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，向管中加入適量核酸沉淀劑，于-20℃靜置30min以上，在4℃下按照16000×g離心10min后棄上清液，保留沉淀；

8)將步驟7)離心所得沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70～75％乙醇洗滌后室溫風(fēng)干，用DEPC處理水溶解后-80℃保存；

其中，步驟1)、2)、3)、4)可以替代為步驟：

9)取離心管，向離心管中加入700～1000μl裂解緩沖液，并加入5～15μl?β-巰基乙醇，于55～65℃預(yù)熱5～10min；

10)取新鮮植物材料或液氮速凍后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移至步驟9)的離心管中，渦旋1min，于55～65℃保溫20～30min；

按上述方案，所述去糖緩沖液為：0.05M氯化鈉、50mM?pH?8.0的乙二胺四乙酸二鈉、200mM?pH?8.0的三羥甲基氨基甲烷。細(xì)胞裂解液為：30g/L十六烷基三甲基溴化銨、1.4M氯化鈉、50～100mM?pH?8.0的乙二胺四乙酸二鈉、100～200mM?pH?8.0的三羥甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸。所述核酸沉淀劑包括但不限于無水乙醇、異丙醇，使用的無水乙醇體積為上清體積的2～2.5倍，使用異丙醇體積為上清體積的0.8～1倍。

按上述方案，所述方法適用于懸鉤子屬下的樹莓、黑莓以及其他種或變種。所述植物材料包括葉片、花、花蕾以及果實(shí)。