[發(fā)明專利]一種快速提取懸鉤子屬植物總RNA的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110341215.6
• 申請(qǐng)日: 2011-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102329792A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯浩茹;陳清;劉澤靜;王小蓉;余昊唯;賈慧峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種快速提取懸鉤子屬植物總RNA的方法，其特征在于以下操作：

(1)取2ml離心管，向離心管中加入700～1000μl去糖緩沖液，并加入5～15μl?β-巰基乙醇，于-20℃預(yù)冷5～10min；

(2)取新鮮植物材料或經(jīng)液氮速凍后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移至步驟(1)的離心管中，溫柔上下顛倒混勻后于冰上靜置10min；

(3)在4℃下按照3200×g離心5～10min；

(4)徹底去除步驟(3)離心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl?65℃預(yù)熱的細(xì)胞裂解液，渦旋1min，于55～65℃保溫20～30min；

(5)待步驟(4)中的混合液冷卻至室溫后，按順序加入細(xì)胞裂解液等體積的水飽和酚，1/80-1/50裂解液體積的pH調(diào)節(jié)劑，1/5裂解緩沖液體積的氯仿，劇烈震蕩2min；

(6)在4℃下按照16000×g離心5～10min；

(7)將步驟(6)離心所得上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，向管中加入上適量核酸沉淀劑，于-20℃靜置30min以上，在4℃下按照16000×g離心10min后棄上清液，保留沉淀；

(8)將步驟(7)離心所得沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70～75％乙醇洗滌后室溫風(fēng)干，用DEPC處理水溶解后-80℃保存；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)可以替代為：

(1)取2ml離心管，向離心管中加入700～1000μl細(xì)胞裂解液，并加入5～15μl?β-巰基乙醇，于55～65℃預(yù)熱5～10min；

(2)取新鮮植物材料或液氮速凍后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移至步驟(1)的離心管中，渦旋1min，于55～65℃保溫20～30min；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述總RNA提取方法，其特征在于所述去糖緩沖液為：0.05M氯化鈉、50mM?pH?8.0的乙二胺四乙酸二鈉、200mM?pH?8.0的三羥甲基氨基甲烷；

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法，其主要特征在于使用堿性細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，所述細(xì)胞裂解液為：30g/L十六烷基三甲基溴化銨、1.4M氯化鈉、50～100mM?pH?8.0的乙二胺四乙酸二鈉、100～200mM?pH?8.0的三羥甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30；

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法，其特征在于在細(xì)胞徹底裂解后，再使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)混合液pH，使用的pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸；

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法，其特征在于使用的核酸沉淀劑包括但不限于無(wú)水乙醇、異丙醇；

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法，核酸沉淀時(shí)，使用的無(wú)水乙醇體積為上清體積的2～2.5倍；使用異丙醇體積為上清體積的0.8～1倍；

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法，其適用于懸鉤子屬下的樹(shù)莓、黑莓以及其他種或變種；

9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述總RNA提取方法中植物材料包括但不限于果實(shí)、葉片及花。