[發(fā)明專利]卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110340834.3
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102586227A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 傅松濱;岳志超;計薇;金焰;關(guān)榮偉;白靜;陳峰
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，屬于雙微體分離純化技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

雙微體(double?minute?chromosomes，DMs)是細胞中攜帶擴增基因的染色質(zhì)絲形成的環(huán)狀、無著絲粒和端粒、可自主復(fù)制、成對出現(xiàn)的顆粒狀結(jié)構(gòu)，是基因擴增的主要細胞遺傳學(xué)標(biāo)志，是染色體外遺傳單位的一種主要存在形式。DMs參與細胞增殖并為細胞生長提供選擇優(yōu)勢，與腫瘤的演進和細胞耐藥性的形成密切相關(guān)。大量的研究表明，雙微體與衰老、基因組不穩(wěn)定、腫瘤及耐藥密切相關(guān)。針對雙微體的深入研究對于腫瘤遺傳學(xué)的發(fā)展及其臨床應(yīng)用有著重要的意義。?

自從1962年發(fā)現(xiàn)DMs以來，由于普通的分子生物學(xué)技術(shù)不能簡便、高效地獲取DMs，致使我們并不清楚在絕大多數(shù)細胞中DMs的結(jié)構(gòu)及組成。DMs研究的滯后很大程度上是由于缺乏有效的分離手段。在以往的研究中，差速離心(differential?gradientcentrifugation)、流式細胞分選術(shù)(fluorescence?activated?cell?sorting)、通過誘導(dǎo)S期細胞核出芽及微核形成選擇性的捕獲DMs等方法都曾用于DMs的分離和純化，但是這些方法在樣品制備及分離過程中不可避免會有染色體斷裂形成的小片段混入DMs中，嚴重干擾DMs的純度。不同于以上方法，染色體顯微切割技術(shù)可較為成功的從中期分裂相中剝離收集較高純度DMs，但是此方法技術(shù)難度高、工作強度大，且收獲的DMs量極少，對于部分實驗而言無法滿足進一步研究的需要。?

在常規(guī)的凝膠電泳中，凝膠以篩濾形式對DNA分子進行分離，其分離的上限僅為50kb左右。然而對于50kb以上的DNA分子，常規(guī)的電泳方法就失去了其分子篩的作用，所有的DNA分子的移動速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。?

脈沖場凝膠電泳(pulsed?field?gel?electrophoresis，PFGE)是一種分離大分子DNA的方法。在脈沖場凝膠電泳中電場不斷在兩種方向之間變動，DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動，其中相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可以較快的轉(zhuǎn)變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難，因此小分子向前移動的速度比大分子快，從而實現(xiàn)了對大分子DNA的分離。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小10Kb～10Mb范圍的DNA分子，足以使細菌、酵母染色體及經(jīng)稀有限制酶消化的哺乳類動物大片段DNA得以分離，這一獨具的高分辨率使PFGE的應(yīng)用范圍擴展到幾乎所有生物基因組組織結(jié)構(gòu)的研究。目前常用的PFGE的裝置主要有：垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(TAFE)，旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(RGE)，場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(FIGE)，箝位勻強電場系統(tǒng)(CHEF)，程序化自動控制的電泳(PACE)等。CHEF是目前用途最廣的一種PFGE，可分離近10Mb大小的DNA分子。?

脈沖場凝膠電泳的方法可用于射線或限制性內(nèi)切酶等線性化處理后DMs分子大小的鑒定。由于其樣品制備過程中先將細胞包埋于瓊脂糖中，再用細胞裂解及蛋白酶消化以去除細胞中DNA之外的成分，大大減小了操作過程中外界作用力的干擾，降低了染色體斷裂所形成小DNA片段對DMs純度的影響，此外該方法操作簡單可以實現(xiàn)對DMs的高效回收并能充分滿足后期實驗對實驗樣品量的需求。但是盡管如此，要想分離得到純度足夠高并可用于序列分析的DMs特異性DNA還有很大的難度。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了實現(xiàn)對高純度DMs的分離和純化，進而提供一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法。?

本發(fā)明一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法技術(shù)方案步驟如下：?

人卵巢癌細胞UACC-1598的培養(yǎng)及細胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離?

1、樣品制備?