[發明專利]卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法

有效

• 申請號: 201110340834.3
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102586227A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 傅松濱;岳志超;計薇;金焰;關榮偉;白靜;陳峰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，步驟如下：

(1)樣品制備

人卵巢癌細胞UACC-1598在含10％FBS的RPMI-1640培養基中，于5％CO₂、37℃條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70％～80％的人卵巢癌細胞UACC-1598，計數后重懸于PBS，使細胞密度為1～2×10⁸細胞/mL，并在37℃水浴中孵育；加入等體積37℃的1.4％低熔點瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4℃放置10～15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3～5倍體積的細胞裂解液中于37℃水浴中震蕩孵育90min至膠塊透明；棄細胞裂解液并用洗液反復洗膠塊3次后置于3～5倍體積的蛋白酶K溶液，37℃水浴中震蕩孵育6～12小時；洗滌三次后，置于貯存液中4℃保存；

(2)脈沖場凝膠電泳

將制備好的膠塊置于0.5％瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔；在10℃的0.5×TBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為：正向電壓梯度：3～5V/cm，起始轉換時間：50～70seconds，終止轉換時間：220～260seconds；負向電壓梯度：2～4V/cm，負向起始轉換時間：15～30seconds，負向終止轉換時間：50～70seconds；總電泳時間：36～45hours，隨后調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子；電泳條件為：電壓梯度：3～6V/cm；脈沖角度：120，起始轉換時間：100～130seconds；終止轉換時間：270～320seconds；電泳時間：25～30hours，以商品化的H.wingi和S.cerevisiae染色體為分子量標尺；

(3)瓊脂糖酶法回收DMs?DNA

對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊并稱重，加入1/10體積的10×瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應體系；于70℃10min熔化低熔點瓊脂糖凝膠后，冷卻至60℃并靜置5min，加入瓊脂糖酶于60℃消化1小時，冰上放置15min后12000r/min離心15min，取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻后-20℃冷卻6～12小時，之后，12000r/min離心15min，棄上清用70％的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。

2.根據權利要求1所述的卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的細胞裂解液由0.01mol/L?Tris-HCl?pH8.0、0.05mol/L?NaCl、1％十二烷基肌氨酸鈉、0.1mol/L?EDTA和0.2％SDS制成。

3.根據權利要求2所述的卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的Washing?buffer由0.01mol/L?Tris-HCl和0.1mol/L?EDTA制成。

4.根據權利要求3所述的卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的蛋白酶K溶液由0.1mol/L?EDTA、1％十二烷基肌氨酸鈉、0.2％SDS和1mg/mL蛋白酶K制成。

5.根據權利要求4所述的卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的貯存液由0.001mol/L?Tris-HCl和0.01mol/L?EDTA制成。

6.根據權利要求5所述的卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的電泳條件為：0.5％瓊脂糖凝膠、10℃的0.5×TBE電泳緩沖液。