[發明專利]用于檢測小鼠白血病病毒的引物、探針及其方法

有效

• 申請號: 201110340743.X
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102337359A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 譚淑萍;李萃;王剛;蔣立新;周志文
• 申請（專利權）人: 舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種用于檢測小鼠白血病病毒的引物、探針及其方法。

背景技術

自然感染實驗動物的病毒很多，根據對人類的危害性，可將其分為三類；一類為人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物；二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性；三類病毒在自然條件下僅感染動物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。

現今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的病毒污染。在《中華人民共和國藥典(2010年版)》三部中，規定了鼠源性生物制品需質檢的8種鼠源病毒，其中小鼠白血病病毒屬于II類，目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性。鼠源性病毒檢測標準的制定對客觀評價生物制品質量，確保人民健康必將起到積極的作用。

小鼠白血病病毒(Murine?leukemia?virus，簡稱MuLV或MLV)是反轉錄病毒科(Retroviridae)哺乳動物C型逆轉錄病毒屬。這種病毒因為可以引起小鼠宿主癌癥而得名，因此又被稱作致癌RNA病毒。某些鼠白血病病毒可能會感染其他脊椎動物。鼠白血病病毒包括外源性病毒和內源性病毒。以外源形式存在的病毒可以從一個宿主轉移到另一個宿主。鼠白血病病毒的基因組是一條正義、單鏈RNA，感染細胞后，病毒RNA反轉錄為DNA，整合到宿主細胞基因組中。

MLV共有三種基因型：Abelson?murine?leukemia?virus(AbMLV)，Moloney?murine?leukemia?virus(MoMLV，或Moloney?virus)和Friend?murine?leukemia?virus(FrMLV)，均以發現者姓名來命名。

藥典規定的鼠源病毒檢測方法有：細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗。這些方法從生物效應角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求，不宜作為一種常規的指導生產的質控手段。

而目前發展十分成熟的實時熒光定量PCR技術(Real-time?Fluorence?Quantitative?Polymerase?Chain?Reaction簡稱Real?Time?PCR)檢測靈敏度高，簡單方便，且對實驗室要求也很低。Real?Time?PCR于1996年由美國Applied?biosystems公司推出，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or?cDNA)的起始濃度進行定量分析的方法。該方法自產生以來，不斷發展完善，特別是隨著Taqman熒光探針的廣泛應用，到目前為止該技術已經非常成熟。Taqman熒光探針的PCR檢測是指進行PCR擴增時，在反應體系中加入一對引物的同時還加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基因和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基因所發射的熒光信號被淬滅基因吸收，擴增時隨著Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5’-3’外切核酸酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可以監測到熒光信號，模板每復制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一關系，所以信號累積與PCR產物完全同步。整個反應結束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及樣品中的擴增曲線可對樣品進行定量分析。

實時熒光定量PCR技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該已被廣泛用于免疫分析、細菌、病毒檢測等多個領域。迄今為止，實時熒光定量PCR技術檢測小鼠白血病病毒方面還未見有報道，無疑有著很廣闊的發展空間。

發明內容

為了解決現有小鼠白血病病毒檢測方法的不足，本發明提供了一種實時熒光定量PCR檢測小鼠白血病病毒的引物、探針及其方法，該方法簡單方便、靈敏度高且檢測時間短。

本發明的一個目的是提供一對用于檢測小鼠白血病病毒的引物。

本發明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ?ID?NO：1的上游引物與具有序列表中的SEQ?ID?NO：2的下游引物組成的一對寡核苷酸。