[發明專利]嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法

有效

• 申請號: 201110339776.2
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102443628A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 王昱;肖進文;李賢良;聶福平;李應國;楊俊
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明屬于分子生物學方法進行微生物（病毒、細菌、支原體和真菌等）的檢測領域，具體是一整套制備和合成嵌合外源無關序列DNA或RNA質控的技術方法。

背景技術

基于基于核酸的分子生物學檢測方法或檢測試劑盒都需要通過添加標準陽性質控樣品，用以檢驗檢測過程的有效性，但是，全部來源于檢測對象的標準陽性樣品的添加往往會對檢測反應帶來潛在的污染和判讀的干擾。目前用于分子診斷試劑盒中的主要質控樣品主要是具有感染活性的病毒血清，如王露楠等制備的丙型肝炎病毒標準質控：用?HCV?RNA陰性血漿將陽性血漿稀釋至含量約300?000拷貝數/mL,然后進行真空冷凍干燥.檢測方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應方法和羅氏公司的PCR內標定量方法。該法制備的標準質控樣品具有感染活性，容易導致病毒的擴散和傳播。Satoshi?Inoue等制備的用于炭疽桿菌分子診斷中的質控樣品，在質控DNA中引入EcoRV和BamHⅠ兩個酶切位點用于鑒別是否由于質控的污染而導致的假陽性擴增（Satoshi?Inoue,?2004）。更為精湛的質控核酸的制備方法來自Laetitia?Ninove在2011年發表的論文：使用人工合成的含有T7啟動子引物、NotI酶切位點、檢測引物（探針）序列和病毒基因序列的質控DNA（RNA）序列用于各類分子檢測方法的外源性質控（Laetitia?Ninove,?2011）。后兩者的共同之處是，制備的質控樣品均無感染性，但是均主要嵌合的是檢測對象本身（或類似）的核酸序列和1~2個常見的酶切位點來鑒別檢測結果中的假陽性和真陽性，鑒別精度低、鑒別反應復雜。

本發明通過在無關序列（質粒載體序列或人工隨機序列）的兩側，通過基因克隆法或化學合成法添加待測微生物特異性引物序列，然后利用PCR克隆的辦法獲得嵌合無關序列的DNA質控，進一步利用體外轉錄技術即可獲得可以作為檢測試劑盒的RNA質控。本發明制備的核酸質控均含有一段和檢測對象完全無關的基因序列，在后續的陽性排查中，使用一個針對無關序列的PCR反應即可鑒別檢測結果中的假陽性和真陽性。在陰性對照正常的條件下，核酸質控樣品的陽性擴增，指征檢測反應的有效和正確。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于PCR檢測的DNA質控和一種用于RT-PCR檢測的RNA質控。

為了實現上述目的本發明采用如下技術方案：（1）無關序列來源及選擇：包括方法Ⅰ或方法Ⅱ，當檢測反應為基于產物長度時選用方法Ⅰ，當方法Ⅰ不能滿足實際需要，特別是檢測反應為taqman?實時定量PCR或類似中間含探針的檢測反應時選用方法Ⅱ。

所述方法Ⅰ：從現有的質粒載體上選取一段DNA序列，用生物學軟件分析該DNA序列的GC含量和二級構象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關序列Ⅰ：a）無關序列Ⅰ與待檢測微生物的同源性低于5%，b）GC含量在45%～55%之間，c）二級結構較為簡單，d）平均TM值在60℃～85℃之間。

所述方法Ⅱ：采用化學法合成一段無關序列Ⅱ，滿足無關序列Ⅱ和待檢測微生物無同源性。

（2）引物的設計

利用引物設計的一般原理針對步驟（1）方法Ⅰ中所述無關序列Ⅰ和待檢測微生物分別設計一對無關序列Ⅰ引物和一對待檢測微生物特異性引物Ⅰ，在無關序列Ⅰ引物的上游和無關序列Ⅰ引物的下游的5′端分別加入待檢測微生物特異性引物Ⅰ上游和待檢測微生物特異性引物Ⅰ下游，得到一對嵌合引物。

用引物設計的一般原則針對待檢測微生物設計一對待檢測微生物特異性引物Ⅱ和待檢測微生物探針，還需要針對無關序列Ⅱ設計一對無關序列Ⅱ引物；合成一段從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物Ⅱ、無關序列Ⅱ、待檢測微生物探針、無關序列Ⅱ、待檢測微生物下游引物Ⅱ的DNA片段。

（3）PCR擴增

用步驟（2）中所述嵌合引物，PCR擴增步驟（1）方法Ⅰ所述現有的質粒載體，獲得雙鏈DNA序列產物Ⅰ：產物Ⅰ從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物Ⅰ、無關序列Ⅰ上游引物、無關序列Ⅰ、無關序列Ⅰ下游引物和待檢測微生物下游引物Ⅰ。

用步驟（2）中所述待檢測微生物特異性引物ⅡPCR擴增步驟（2）所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產物Ⅱ：從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物序列Ⅱ、無關序列Ⅱ上游引物、無關序列Ⅱ、待檢測微生物探針、無關序列Ⅱ、無關序列Ⅱ下游引物、待檢測微生物下游引物Ⅱ。

（4）克隆