[發明專利]嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法

有效

• 申請號: 201110339776.2
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102443628A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 王昱;肖進文;李賢良;聶福平;李應國;楊俊
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

1.嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法，包括如下步驟：

（1）無關序列來源及選擇：包括方法Ⅰ或方法Ⅱ，當檢測反應為基于產物長度時選用方法Ⅰ，當檢測反應為taqman?實時定量PCR或類似中間含探針的檢測反應時選用方法Ⅱ；

所述方法Ⅰ：從現有的質粒載體上選取一段DNA序列，用生物學軟件分析該DNA序列的GC含量和二級構象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關序列Ⅰ：a）無關序列Ⅰ與待檢測微生物的同源性低于5%，b）GC含量在45%～55%之間，c）二級結構較為簡單，d）平均TM值在60℃～85℃之間；

所述方法Ⅱ：采用化學法合成一段無關序列Ⅱ，滿足無關序列Ⅱ和待檢測微生物無同源性；

（2）引物的設計

利用引物設計的一般原理針對步驟（1）方法Ⅰ中所述無關序列Ⅰ和待檢測微生物分別設計一對無關序列Ⅰ引物和一對待檢測微生物特異性引物Ⅰ，在無關序列Ⅰ引物的上游和無關序列Ⅰ引物的下游的5′端分別加入待檢測微生物特異性引物Ⅰ上游和待檢測微生物特異性引物Ⅰ下游，得到一對嵌合引物；

用引物設計的一般原則針對待檢測微生物設計一對待檢測微生物特異性引物Ⅱ和待檢測微生物探針，還需要針對無關序列Ⅱ設計一對無關序列Ⅱ引物；化學合成一段從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物Ⅱ、無關序列Ⅱ、待檢測微生物探針、無關序列Ⅱ、待檢測微生物下游引物Ⅱ的DNA片段；

（3）PCR擴增

用步驟（2）中所述嵌合引物，PCR擴增步驟（1）方法Ⅰ所述現有的質粒載體，獲得雙鏈DNA序列產物Ⅰ：產物Ⅰ從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物Ⅰ、無關序列Ⅰ上游引物、無關序列Ⅰ、無關序列Ⅰ下游引物和待檢測微生物下游引物Ⅰ；

用步驟（2）中所述待檢測微生物特異性引物ⅡPCR擴增步驟（2）所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產物Ⅱ：從5′端到3′端依次是待檢測微生物上游引物序列Ⅱ、無關序列Ⅱ上游引物、無關序列Ⅱ、待檢測微生物探針、無關序列Ⅱ、無關序列Ⅱ下游引物、待檢測微生物下游引物Ⅱ；

（4）克隆

瓊脂糖電泳PCR產物，使用膠回收試劑盒回收產物Ⅰ或產物Ⅱ，在分光光度計法定量后，TA連接產物Ⅰ或產物Ⅱ到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉化子，獲得陽性轉化子pGEM-T-產物Ⅰ或pGEM-T-產物Ⅱ，即所需的DNA質控Ⅰ或DNA質控Ⅱ；將DNA質控Ⅰ或DNA質控Ⅱ轉化并保存于大腸桿菌工程菌中；

（5）體外轉錄和純化

將pGEM-T-產物Ⅰ或pGEM-T-產物Ⅱ經過單酶切進行線性化，酶切位點位于插入基因外，利用體外轉錄試劑盒進行體外RNA的合成，獲得RNA質控Ⅰ或RNA質控Ⅱ；

純化步驟為：a）補充無RNAse酶滅菌水至100μL，然后加入900?μL?TriPure?Isolation?Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5?min，加入?200?μL?氯仿，震蕩60?s，然后于4℃，12000?r/min高速離心15?min；2）取500?μL上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置30?min,?12000?r/min高速離心15?min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3）然后加入1?mL?75%乙醇，保存于-80℃冰箱或液氮。

2.根據權利要求1所述嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述DNA片段長度在80bp～1000bp之間，無關隨機待檢測微生物探針5’端到待檢測微生物上游引物Ⅱ3’端的距離在5~50bp之間。

3.權利要求1所述的嵌合外源無關序列的核酸質控在制備適用于分子診斷或檢測試劑盒核酸質控品的用途。