[發明專利]一種可克隆微藻啟動子的T載體的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110339260.8
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102399811A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 王潮崗;胡章立
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12Q1/68;G01N33/53
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及微藻基因工程領域，更具體涉及一種微藻啟動子克隆T載體的構建方法，同時還涉及一種微藻啟動子克隆T載體的用途，可用于微藻啟動子的直接克隆并在萊茵衣藻中分析該啟動子的功能，該方法可快速克隆微藻啟動子并進行功能分析。?

背景技術

啟動子是基因調控中普遍存在的順式作用元件，是RNA聚合酶能夠識別并與之結合而起始基因轉錄的一段DNA序列，通常位于基因5′端上游。它能決定轉錄的方向和效率，以及RNA聚合酶類型，并引導RNA聚合酶與模板的正確結合。因此，啟動子的功能序列對于基因的表達調控機制的研究具有十分重要的意義。研究啟動子功能的手段之一就是通過基因工程手段。它是分子生物實驗的基本技術之一，即將一段需要克隆的外源DNA片段插入到載體DNA分子中形成重組DNA分子，然后將該重組載體轉運到宿主細胞中，隨著宿主細胞的繁殖載體進行復制，在這一系列過程中與載體相連的外源基因片段同時被克隆。傳統的克隆方法是：限制性酶切目的片段后再連接到載體的相應位點上，該方法存在效率低、耗時長等缺點。于是研究人員又開發出了T載體，它是一種很方便的克隆載體，因其末端帶有突出的T堿基，可直接與Taq酶擴增產物末端突出A堿基配對，大大提高了PCR產物與載體的連接效率。它是一種方便、高效的克隆載體，進行大量的克隆工作時，現實、簡便的做法是使用商業化的T載體，常用的T載體包括pMD-18T、pGEM-T和pCF-T等。常見的T載體制備包括：首先是通過酶切得到平末端，然后在末端連入T堿基，此方法需要消耗大量的載體和酶，成本高，耗時長。通過分子生物學操作在載體兩段引入Eam1105I等限制性內切酶位點，通過酶切直接獲得T載體，此方法更高效、簡便。?

藻類是含有光合色素，營自養生活，沒有根莖葉分化的低等孢子植物類群，對藻類基因啟動子的研究是從1990年代初對聚球藻的研究開始的。它的研究相對高等植物落后很多，水稻、煙草和擬南芥等高等植物的啟動子已經做了很多的研究，它們已經建立了穩定的遺傳轉化體系，可以購買到各種克隆載體、轉化載體、報告蛋白和抗體等，其他高等植物的啟動子也可以在擬南芥、煙草等模式生物中進行功能研究。然而，藻類基因表達調控的研究就相對較少，主要集中于藻類光合作用與固氮作用相關基因的啟動子，真核微藻主要集中在小球藻和萊茵衣藻上。微藻的調控機制與高等植物差別很大，因此研究人員無法利用煙草、擬南芥等成熟的模式生物對其啟動子功能進行研究。這大大妨礙了微藻的相關研究，尤其是某些重要基因的調控機理研究。其他如雨生紅球藻、硅藻和擬微綠球藻等經濟微藻由于研究歷史較短，目前還沒有成熟的載體和表達系統對其啟動子功能進行研究，因此，微藻啟動子功能研究存在的主要問題有以下幾方面：?

(1)目前還沒有商業化的微藻克隆載體、表達載體或報告載體，大大阻礙了研究工作的開展；?

(2)許多微藻包括雨生紅球藻等還沒能建立遺傳轉化體系，不能通過基因工程手段對其功能基因進行研究，也不可能對其啟動子的調控功能進行研究；?

萊茵衣藻是目前研究最多、技術最成熟的微藻，它是單細胞、帶鞭毛的真核生物，隸屬于綠藻門，團藻目，衣藻屬.衣藻的結構簡單，原生質膜緊貼著細胞壁，頂端長有兩根鞭毛，側面具有一個眼點，多數細胞還有一個或多個液泡，一個占細胞總體積近40％的大型杯狀葉綠體。衣藻因其培養條件簡單；生長周期短；生長迅速；光合效率高而具有“光合酵母”之稱.其生物學特性為在短時間內獲得大量遺傳穩定的轉基因后代，并進行遺傳學分析提供了便利條件。它也是少數三套基因組均能進行遺傳轉化的植物之一。長期以來，萊茵衣藻由?于其自身的特點，一直被用作遺傳研究的材料。廣泛用于研究鞭毛結構和鞭毛組裝，趨光性和生理節律，配子發生和交配和光合作用原理，葉綠體發育的分子生物學過程等，這些研究加深了我們對衣藻生理功能和遺傳學的認識。它還有一個很大的優勢，它作為微藻的模式生物進行了全基因組測序，這些研究和基因組數據使得衣藻的遺傳學背景很清晰。所以，萊茵衣藻非常適合作為研究微藻的模式生物，包括功基因功能的研究，還可以用于研究微藻啟動子的調控機理。?

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種微藻啟動子的T載體的制備方法，該方法通過簡單的PCR等分子生物學操作就可構建T載體，對操作人員要求不高，本發明詳細提供了各步操作以及引物，技術成熟可靠，操作人員遵循該法即可得到T載體。可以利用該載體快速克隆微藻啟動子，并在萊茵衣藻中進行啟動子功能的驗證，成為微藻基因工程研究人員的有利工具。?