[發(fā)明專利]一種可克隆微藻啟動子的T載體的制備方法及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110339260.8
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102399811A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設計）人: 王潮崗;胡章立
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12Q1/68;G01N33/53
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種可克隆微藻啟動子的前T載體的制備方法，其步驟是：

A、可克隆微藻啟動子的前T載體的構建：

(1)以pBle1：5′-GTAGATATCATGGCCAGGTG-3′，pBle2：5′-GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC-3′)為引物，通過PCR從質粒pSP124中擴增出大小為970bp的ble-RBCS2終止子：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，25個循環(huán)，72℃10min，克隆進pMD?18-T載體中，獲得T-p124質粒，并經測序確認，通過EcoRⅤ和Kpn?Ⅰ限制性內切酶雙酶切質粒T-p124獲得ble-3′RBCS2終止子，將它插入pSP124載體的EcoRⅤ和Kpn?Ⅰ酶識別位點，獲得pB124載體；

(2)pB載體的構建：通過Eam1105Ⅰ限制性內切酶單酶切pB124載體，獲得線性載體，再經T4DNA?Polymerase使載體末端平滑化，突變原有的Eam1105Ⅰ酶識別位點，通過T4連接酶連接載體，獲得pB載體；

(3)pRB載體的構建：通過Eam1105Ⅰ單酶切pSP124載體(含RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子)，獲得線性載體，再經T4DNA?Polymerase使載體末端平滑化，突變原有的Eam1105Ⅰ酶識別位點，通過T4連接酶連接載體，獲得pRB載體；

(4)間隔序列的獲得：以pB-bkt9：5′-TTGGATCCGACTTTACGTCCAGTTCCGTGACATTGA-3′，pB-bkt10：5′-CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTATG-3′為引物，通過PCR從質粒091127-a3中擴增出大小為450bp的產物，獲得引入兩個Eam1105Ⅰ酶識別位點、一個EcoRⅤ和BamH?Ⅰ酶識別位點的啟動子，作為前T載體的間隔序列并命名為5′bkt1-0.45；

(5)pB-0.45T載體的構建：通過EcoRⅤ和BamH?Ⅰ限制性內切酶雙酶切5′bkt1-0.45，將其插入pB載體的EcoRⅤ和BamH?Ⅰ酶識別位點，獲得pB-0.45T載體；

(6)pRB-0.45T載體的構建：通過EcoRⅤ和BamH?Ⅰ限制性內切酶雙酶切5′bkt1-0.45，將其插入pRB載體的EcoRⅤ和BamH?Ⅰ酶識別位點，最后獲得pRB-0.45T載體；

B、啟動子序列的T克隆：

(1)T載體的制備：

pB-0.45T載體和pRB-0.45T載體經Eam1105I限制性內切酶雙酶切，37℃1小時，酶切產物經1％質量體積比瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收大片段即為T載體，經一般的商業(yè)回收試劑盒純化后直接應用于PCR片段的T克隆；

(2)啟動子的PCR擴增：

PCR擴增后能在產物末端加腺嘌呤脫氧核苷酸(A)的PCR酶，常見的有Taq?DNA擴增酶和長鏈DNA擴增酶，采用Pfu高保真酶擴增，在PCR產物上通過Taq擴增酶加腺嘌呤脫氧核苷酸才能用T載體；

(3)PCR片段的連接、轉化：

T載體和PCR產物按1∶1或1∶3摩爾比混勻，加入T4連接酶連接，轉化到感受態(tài)大腸桿菌XL1細胞中，經氨芐抗生素篩選獲得克隆了啟動子PCR片段的重組子，經T3或T7引物測序確定插入片段的序列信息。

2.權利要求1所述的一種可克隆微藻啟動子的T載體在檢測微藻啟動子功能中的應用。