[發明專利]一種血清中痕量內源性磷酸化肽的富集方法

無效

• 申請號: 201110337991.9
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN103091153A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李秀玲;萬慧慧;梁鑫淼
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種血清中痕量內源性磷酸化肽的富集方法，其特征在于：

首先將血清樣品采用濾膜截留，然后利用金屬氧化物富集濾膜濾過液中的痕量內源性磷酸化肽；

所述濾膜的截留分子量在5000-20000Da之間；

所述金屬氧化物材料包括氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁、或者這些金屬的復合金屬氧化物中的一種或二種以上。

2.按照權利要求1所述方法，其特征在于：

金屬氧化物材料的粒徑大小為0.2-100微米，孔道直徑大小為1-100納米。

3.按照權利要求1所述方法，其特征在于：

濾膜截留的具體操作采用離心模式；

在離心模式下，血清樣品經溶液稀釋后，轉移至濾膜管中，用離心機離心，得到過濾液；

血清樣品稀釋時采用的稀釋溶液為下述溶劑之一，

1)體積濃度為5-60％甲醇，pH?2-7；

2)體積濃度為1-20％乙腈，pH?2-7；

3)體積濃度為1-40％乙醇溶液，pH?2-7；

稀釋溶液的用量為2-20倍血清樣品體積。

4.按照權利要求3所述方法，其特征在于：離心溫度為4-35℃，離心速率為5000-20000g，離心時間是0.1-48小時。

5.按照權利要求1所述方法，其特征在于：

金屬氧化物富集磷酸化肽的具體操作采用柱固相萃取模式或在離心模式；

在柱固相萃取模式下采用金屬氧化物富集磷酸肽時，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后上樣到以金屬氧化物為填料的SPE柱上，采用沖洗溶劑洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑富集磷酸化肽；

或在離心模式下，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后金屬氧化物混合，采用沖洗溶劑洗脫、離心洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑洗脫、離心富集得到磷酸化肽；

沖洗非磷酸化肽時采用的沖洗溶劑為下述溶劑之一，

1)含有30-500mg/mL乳酸的體積濃度為20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?2.0-4.3；

2)含有1％-5％三氟乙酸的體積濃度為20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?1-3；

3)含有1％-5％甲酸的體積濃度為20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?1-4；

洗脫磷酸化肽時采用的洗脫溶劑為下述溶劑之一，

1)體積濃度為1-10％的氨水溶液，pH?10-13；

2)體積濃度為1-10％的吡咯溶液，pH?10-13。

6.按照權利要求5所述方法，其特征在于：柱固相萃取模式下或離心模式下，

金屬氧化物與濾膜的過濾液質量比例為10-200∶1，富集溫度為4-60℃。

7.按照權利要求5所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于：

沖洗溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的沖洗溶液；洗脫溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的洗脫溶液。