[發明專利]一種血清中痕量內源性磷酸化肽的富集方法

無效

• 申請號: 201110337991.9
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN103091153A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李秀玲;萬慧慧;梁鑫淼
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及生化分析領域，具體地說是濾膜過濾結合金屬氧化物在富集內源性磷酸化肽中的應用。

背景技術

蛋白質磷酸化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾(Post?Translational?Modifications，PTMs)，參與并調控著生命活動的幾乎所有過程，包括細胞增殖、分化，神經活動和新陳代謝等。異常的蛋白質磷酸化是人類疾病發生的根本原因之一。所以建立高靈敏度和高通量的磷酸化蛋白檢測方法，對于進一步理解生命進程、發現與疾病相關的生物標志物具有重要意義。目前由于生物樣品中磷酸化肽的含量低，并且在質譜檢測中大量的非磷酸化肽段嚴重抑制磷酸化肽的離子信號，導致對磷酸化蛋白的鑒定具有挑戰性。因此在質譜分析前高選擇性的富集內源性磷酸化肽非常重要。固定金屬離子親和色譜(IMAC)如Ga³⁺-IMAC和Fe³⁺-IMAC和金屬氧化物親和色譜(MOAC)如TiO₂等因其對磷酸化肽的高選擇性被廣泛應用于磷酸化蛋白組學研究中。

血清中含有來源于幾乎所有細胞、組織的蛋白及代謝產物，能夠直接反映機體的生理、病理狀況，是對各種疾病研究的最有價值的樣本之一。但由于血清成分極其復雜，同時具有很高的動態范圍，使得血清中內源性磷酸化肽的檢測面臨巨大挑戰，至今相關報道很少。Hu?L.H.等利用一種基于有序介孔材料的固定化鈦離子親和色譜(Ti⁴+-IMAC)材料直接從人的血清中富集并檢測到4個內源性磷酸化肽[Hu?LH，Zhou?HJ，Li?YH，Sun?ST，Guo?LH，Ye?ML，Tian?XF，Gu?JR，Yang?SL，Zou?HF.Anal.Chem.，2009，81(1)：94-104]。我們利用氧化鋯(ZrO₂)包覆介孔氧化硅材料直接從人血清中富集到12個內源性磷酸化肽[Wan?HH，Yan?JY，Yu?L，Zhang?XL，Xue?XY，Li?XL，Liang?XM.Talanta，2010，82(5)：1701-1707]。以上兩種方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根與富集材料中的金屬元素相互作用實現了磷酸化肽的選擇性富集。但是血清樣品中含有大量的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，這些化合物都含有磷酸根，特別是RNA和DNA中含有的大量的磷酸根。這些含有磷酸根的化合物可能在上樣過程中與低豐度的磷酸化肽競爭富集材料上的作用位點，從而降低了血清中磷酸化肽的富集選擇性。因此，如何有效地去除這些大分子量干擾化合物，提高血清中低豐度磷酸化肽富集檢測方法至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種血清中痕量內源性磷酸化肽的富集方法，能對痕量磷酸化肽進行選擇性富集。

本發明采用的技術方案為：

一種血清中痕量內源性磷酸化肽的富集方法，首先將血清樣品采用濾膜(ultrafiltration?membrane)截留、去除血清中的大量蛋白、DNA和RNA等大分子量干擾化合物，降低了樣品的復雜性，然后利用金屬氧化物富集濾膜濾過液中的痕量內源性磷酸化肽；

所述濾膜的截留分子量在5000-20000Da之間；

所述金屬氧化物材料包括氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁、或者這些金屬的復合金屬氧化物中的一種或二種以上。

金屬氧化物材料的粒徑大小為0.2-100微米，孔道直徑大小為1-100納米。

濾膜截留的具體操作采用離心模式；

在離心模式下，血清樣品經溶液稀釋后，轉移至濾膜管中，用離心機離心，得到過濾液；

血清樣品稀釋時采用的稀釋溶液為下述溶劑之一，

1)體積濃度為5-60％甲醇，pH?2-7；

2)體積濃度為1-20％乙腈，pH?2-7；

3)體積濃度為1-40％乙醇溶液，pH?2-7；

稀釋溶液的用量為2-20倍血清樣品體積。

離心溫度為4-35℃，離心速率為5000-20000g，離心時間是0.1-48小時。

金屬氧化物富集磷酸化肽的具體操作采用柱固相萃取模式或在離心模式；

在柱固相萃取(SPE)模式下采用金屬氧化物富集磷酸肽時，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后上樣到以金屬氧化物為填料的SPE柱上，采用沖洗溶劑洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑富集磷酸化肽；

或在離心模式下，將濾膜的過濾液與金屬氧化物混合，采用沖洗溶劑洗脫、離心洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑洗脫、離心富集得到磷酸化肽；