[發明專利]豬瘟病毒核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針

有效

• 申請號: 201110336911.8
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102676690A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 胡萌;王業富;周康平;邱楊;劉建麗
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種豬瘟病毒核酸定量檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

豬瘟病毒(Classical?Swine?Fever?Virus，CSFV)，為黃病毒科，瘟病毒屬，只有一個血清型，但型內可分為多個基因型。病毒粒子有囊膜，直徑為40～50nm，基因組由單股負鏈RNA構成，僅含一個大開放閱讀框。對于CSFV的診斷，目前核酸針對的目標區域主要為5’UTR、E2、NS4B及NS5B。本發明確定目標基因為E2，E2為四種結構蛋白C、Erns、E1及E2之一，為囊膜上的主要結構糖蛋白之一。同時研究也表明E2分子含4個抗原結構域A、B、C和D，A區又分為A1、A2、A3三個亞區，在功能上，A1、B、C為中和性抗原區，其他幾個為非中和抗原區。目前豬瘟主要在亞洲、歐洲、非洲、中南美洲的國家與地區流行。近幾年豬瘟疫情在我國又呈現上升的趨勢，其流行和發病特點也發生了很大變化，在臨床表現上趨于復雜化，出現了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”。目前豬瘟在我國普遍出現免疫失敗和疾病非典型化現象，多表現為發熱、精神沉郁、食欲減退、咳嗽、共濟失調、結膜炎以及腹瀉、圍產期死亡、死胎、流產等。因此有必要對豬瘟的分子流行病學情況進行分析。E2(gp55)是CSFV最具抗原性的糖蛋白基因，而且是全基因組中最易變異的部分之一，能誘導高滴度的中和抗體，在保護性免疫應答中發揮重要作用。

現有技術中豬瘟病毒的快速檢測方法如下：

1、病毒分離法

為病毒性疾病診斷最常用以及高度敏感的方法之一。分離出的病毒再經電子顯微鏡、免疫學技術或分子生物學進一步鑒定。大致操作為獲取病毒分離的樣品、病毒分離操作、接種后觀察或其他方法。分離出的病毒可用于長期保存，抗原性、基因特性或藥物敏感性等分析，但也存在一定的使用限制。目前最常用的分離病毒的組織系一般為MDCK，而雞胚則是最常用的活體。大多數毒株均可適應于該細胞，將病料或其它處理，接種到細胞系上，3～4天可見CPE，表明病毒分離。總體而言，病毒分離認為檢測病毒的一種經典、準確、敏感的病原學診斷金標準，特異性和敏感性均較高，但較為費時。

2、電子顯微鏡技術

電鏡已成為病毒研究的常規手段之一，可以很直觀地顯示病毒粒子的形態結構、病毒在寄主細胞內的存在狀態、寄主細胞的結構變化、以及病毒的復制和裝配等過程。電子顯微鏡技術分常規電鏡和免疫電鏡。可用電子顯微鏡直接觀察到豬瘟病毒顆粒或感染部位組織。常規電鏡法樣品用量小、制樣速度快、觀察比較直觀，但觀察靈敏度較低，要求樣品的病毒量大。而免疫電鏡法較常規電鏡法的敏感性高，但樣品制備過程較復雜，對操作者的技能要求較高。在此基礎上還研究開發出了一些新方法及技術，如免疫電子顯微鏡或固相免疫電子顯微鏡，這些方法是利用抗原抗體反應并通過負染色在電子顯微鏡下進行觀察，靈敏度相對提升了許多，但相應的樣品制備過程較復雜，對操作者的技能要求較高。

3、血清學實驗

血清學檢測方法主要是檢測甲病毒感染過程中產生的抗原抗體免疫標志物，主要包括免疫過氧化物單層試驗(IPMA)、免疫熒光試驗(IFA)、酶免疫法(EIA)和血清中和試驗等。血清學測定的靈敏度高于電子顯微鏡，但其特異性低，實驗室診斷方面局限性較大。此外，由于該技術建立于病毒抗原識別的基礎之上，病毒的抗原多樣性會對該技術的應用產生影響。操作上較為簡單快速，但現有的方法缺乏足夠的敏感性和特異性，如不能準確區分甲型H1N1流感與季節性流感，且不能檢測新變異的毒株。