[發(fā)明專利]豬瘟病毒核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110336911.8
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102676690A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡萌;王業(yè)富;周康平;邱楊;劉建麗
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

1.一種豬瘟病毒核酸定量檢測引物和探針，包括如下的序列組：

1）包括下述正向引物，反向引物和熒光探針的一組序列：

正向引物：5'-AACGGYAGTGCTTTCTAYC-3'，

反向引物：5'-GTGGRAAAGGCTTCTCTC-3'，

熒光探針：5'-?accActTctGtyCtca?-3'，其中下標為LNA修飾；

2）上述1）中序列的5’?端和/或3’?端有延長的核苷酸片段的一組序列；

3）與上述1）或2）中序列的同源性大于85%，且具有特異性的一組序列；

4）與上述1）或2）或3）中序列的堿基互補的一組序列；

5）上述1）、2）和3）中任何三個或多個序列形成的具有正向引物、反向引物以及與之向?qū)?yīng)的熒光探針的序列組；

其中，所述序列中Y為C或T，R為A或G。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的引物及探針，其特征在于，其中熒光探針的5’端修飾的熒光染料選自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修飾的熒光染料選自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

3.含有權(quán)利要求1或2所述引物和探針的豬瘟病毒核酸定量檢測試劑盒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括以下試劑中的一種或多種：

（1）PCR反應(yīng)液；

（2）RNA提取液；

（3）陰性質(zhì)控品，為不含豬瘟病毒E2基因的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA片段；

（4）陽性質(zhì)控品，為含1.0×10⁶?copy/ml豬瘟病毒基因組DNA片段；

（5）臨界陽性質(zhì)控品，為含1.0×10⁴?copy/ml豬瘟病毒基因組DNA片段；?

（6）工作標準品。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其中，（1）PCR反應(yīng)液，包括DEPC處理水、具有5’→3’外切活性的HotStart?Taq?DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTP?Mix、10×PCR?Buffer、MgCl₂溶液，所述引物及探針溶于PCR反應(yīng)液中。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述RNA提取液分為溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5，其中溶液1為Trizol試劑，溶液2為氯仿，溶液3為異丙醇，溶液4為75%乙醇，溶液5為DEPC處理水。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標準品包括：

a、工作標準品1，含有1.0×10^7?copy/ml的豬瘟病毒E2基因的非傳染性DNA片段；

b、工作標準品2，含有1.0×10⁶?copy?/ml的豬瘟病毒E2基因的非傳染性DNA片段；

c、工作標準品3，含有1.0×10⁵?copy?/ml的豬瘟病毒E2基因的非傳染性DNA片段；

d、工作標準品4，含有1.0×10⁴?copy?/ml的豬瘟病毒E2基因的非傳染性DNA片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為：DEPC處理水23.1?μl；5?U/μl的熱啟動Taq酶0.4?μl；200?U/μl?M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1?μl;?Rnase抑制劑0.5?μl；10?mmol/l?的dNTP?Mix?2?μl；?10×一步法RT-PCR?Buffer?5?μl；25?mmol/l的?MgCl₂溶液用量9?μl；10?μmol/l的豬瘟病毒正向引物用量1.5?μl；濃度為10?μmol/l的豬瘟病毒反向引物用量1.5?μl；濃度為10?μmol/l的豬瘟病毒探針用量1?μl。

9.權(quán)利要求1或2所述引物及探針，或權(quán)利要求3~8任一所述試劑盒在檢測豬瘟病毒核酸中的應(yīng)用。

10.一種利用權(quán)利要求3~8任一項所述的試劑盒檢測豬瘟病毒核酸的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

樣品預處理：采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料組織；

（2）RNA提取：取已處理的樣本200?μl，加600?μl溶液1，充分震蕩混勻，室溫靜置10?min；加150?μl溶液2，再次充分震蕩混勻，室溫靜置5?min，13,000?rpm離心15?min，取上清置等體積預冷的溶液3中，溫和顛倒混勻，靜置10?min，12,000?rpm離心10?min，棄上清，加入1,000?μl?75%溶液4洗滌沉淀2次，8,000?rpm離心5?min，去上清，干燥?2～5?min，加15～30?μl溶液5溶解，-80?℃保存；其中溶液1為Trizol試劑，溶液2為氯仿，溶液3為異丙醇，溶液4為75%乙醇，溶液5為DEPC處理水；

（3）加樣：向裝有45?μl?PCR?反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品，工作標準品各5?μl，蓋好管蓋，5,000?rpm離心10?s；

（4）PCR擴增：將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；

42℃?60?min，1個循環(huán)；

????94℃?5?min，1個循環(huán);

????94℃?30?s?，58℃?45?s，5個循環(huán)；

94℃?30?s?，58℃?45?s，35個循環(huán)；收集熒光信號，在反應(yīng)程序的第四步的終了讀取熒光值;

（5）分析判斷：Ct值小于28的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的為臨界陽性。