[發明專利]一種應答水稻白葉枯病菌的基因芯片的制備方法及其基因芯片與應用

無效

• 申請號: 201110336354.X
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102352415A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 黃興奇;劉艷平;程在全;羅玉;晏慧君;余騰瓊;鐘巧芳;李維蛟;李定琴;殷富有;張敦宇;付堅;王玲仙;葉玉;蔣春苗;李娥賢;郭怡卿;王波
• 申請（專利權）人: 云南大學;云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

技術領域

本發明屬基因芯片技術領域。具體涉及一種檢測應答水稻白葉枯病的基因芯片的制備方法及其基因芯片與應用。

背景技術

水稻白葉枯病是僅次于稻瘟病的第二大世界性水稻病害，它的病原菌是黃單胞桿菌水稻致病變種(Xanthomonas?oryzae?pv.?oryzae,?Xoo)，因此，在現有基因芯片先進技術的基礎上，研究出一種適宜認識抗水稻白葉枯病的基因分子基礎，發掘抗水稻白葉枯病的新基因及其相關基因，抗水稻白葉枯病的表達譜，分析抗病相關基因在病原菌處理前后的表達，抗水稻白葉枯病的機制研究的基因芯片的制備方法及其基因芯片，對培育高抗水稻白葉枯病的水稻新品種具有重要意義。

基因芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量預先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交。通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達的信息)。目前基因芯片技術以其快速、高通量、大規模、高度自動化、高度并行性、高靈敏度等優點，已經在大規模DNA測序、基因表達分析、基因型篩選、基因突變及多態性檢測、疾病的診斷及治療、藥物篩選、新基因的發現克隆及功能研究等領域得到了廣泛的應用。

基因芯片按所點DNA的種類不同可分為兩種：寡核苷酸微陣列和cDNA微陣列。寡核苷酸微陣列是指主要利用原位合成法或將已合成好的一系列寡核苷酸固定在介質上，制備成高密度的寡核苷酸陣列，寡核苷酸的長度隨芯片用途不同而不同，但一般在50?bp以內，以8～25?bp為多。寡核苷酸微陣列密集程度高，一致性和可重復性好，但費用高、靈活性差，主要用于DNA序列測定、SNP分析等，也可用于表達譜研究。cDNA?微陣列是指利用點樣法制備的較低密度的玻片或尼龍膜芯片，芯片上固定的探針主要是cDNA?片段。cDNA微陣列對靶基因檢測的特異性好，技術相對簡單、靈活性高，但重復性稍差，主要用于表達譜研究。根據芯片的功能可分為基因表達譜芯片和DNA測序芯片兩類。基因芯片的制作方法主要有兩種，一是Affymetrix公司采用的原位合成法，二是將PCR得到的cDNA、寡核苷酸片段等直接點樣，又叫合成后點樣。對于基因組序列己知的生物，可以直接根據序列設計全基因組基因芯片。用Array?Designer軟件設計引物，在合成DNA片段前用序列同源性搜索軟件分析，保證擴增片段不與基因組其它序列雜交，通過PCR可以擴增獲得代表每個ORF的DNA片段，經純化后可以點到玻片上。而對于基因組序列未知的生物，可以用DNA文庫制備基因芯片。

基因芯片技術已被廣泛應用于基因差異表達檢測，也被逐漸用成植物抗病機理研究手段。用基因芯片檢測表達譜，能提供大量信息有助于闡明防御應答網絡，可分析評價多種防御途徑之間的交流，利于對抗病機制的了解和抗病候選基因的篩選。已有的基因芯片技術研究水稻抗病機制中，是以水稻基因組相關基因制作芯片，提取病原物侵染后水稻葉片組織的RNA，反轉錄成cDNA后再與芯片雜交、分析。但現有技術的cDNA?微陣列的制備上還存在cDNA片段僅來自cDNA文庫，使芯片中的cDNA質粒類型單一，不能全面反應待檢測對象相關的基因的缺陷和不足，也還缺少一些重要材料如能免疫水稻白葉枯病的疣粒野生稻在應答水稻白葉枯病原菌處理（脅迫）后的cDNA?微陣列基因芯片，制約了全面深入認識、研究水稻抗白葉枯病的基因分子機制。

疣粒野生稻（Oryza?meyeriana）對水稻白葉枯病具有高度的抗病性，彭紹裘等用湖南白葉枯病強菌系對云南普通野生稻，藥用野生稻，疣粒野生稻進行檢測，發現疣粒野生稻抗性水平達到免疫級（彭紹裘等，“野生稻多抗(病)性鑒定——高抗白葉枯病的抗源-疣粒野生稻”，《湖南農業科學》?1981年05期?），章琦等鑒定了三種野生稻對水稻白葉枯病的抗性，參試的13個野生稻種共871份材料，抗性測定結果表明：多數野生稻種具有抗性優良的資源，就抗性水平而言，以疣粒野生稻最為突出，參試的疣粒野生稻全部高抗，整個生育期都表現高抗，甚至免疫（章琦,“?水稻白葉枯病抗性的遺傳及改良”。?科學出版社?2007年9月，北京第1版。），因此，進一步利用疣粒野生稻為材料制備應答水稻白葉枯病菌的基因芯片，對發掘抗水稻白葉枯病的新基因及其相關基因，研究疣粒野生稻抗水稻白葉枯病的機制，對于選育抗白葉枯病的水稻新品種具有重要意義和應用前景。

發明內容