[發(fā)明專利]MLPA長(zhǎng)探針制備方法、轉(zhuǎn)基因玉米MLPA長(zhǎng)探針及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110331075.4
• 申請(qǐng)日: 2011-10-27
• 公開（公告）號(hào): CN102399873A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 凌杏園;陳枝楠;章桂明;康林;向才玉;潘廣;陳菲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

1.一種MLPA長(zhǎng)探針的制備方法，所述制備方法包括，

采用引物對(duì)以模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶處理不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳經(jīng)過(guò)酶切處理的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即得到MLPA長(zhǎng)探針；

所述模板為與檢測(cè)靶標(biāo)序列無(wú)關(guān)的序列，所述不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列內(nèi)包括有多克隆位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶與多克隆位點(diǎn)對(duì)應(yīng)；

所述引物對(duì)的一條引物從5’端到3’端依次包括與檢測(cè)靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段；

所述引物對(duì)的另一條引物從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述引物對(duì)中從5’端到3’端依次包括與檢測(cè)靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段的一條引物為不對(duì)稱PCR中的非限定引物，另一條引物為限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修飾。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：所述模板為PUC18質(zhì)粒，所述限制性內(nèi)切酶包括HindIII、EcoR?I中的至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述非限定引物為不對(duì)稱PCR中的上游引物，所述限定引物為下游引物；所述上游引物位于PUC18質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的左側(cè)，含有Seq?ID?No.2所示序列。

5.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA長(zhǎng)探針，其特征在于：所述長(zhǎng)探針的5’端帶有磷酸化修飾，從5’端到3’端依次包括T2、UT、P2區(qū)段，所述P2含有SeqID?No.11所示序列；

所述T2含有Seq?ID?No.3所示序列，所述UT含有Seq?ID?No.12所示序列，

或者所述T2含有Seq?ID?No.5所示序列，所述UT含有Seq?ID?No.13所示序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MLPA長(zhǎng)探針，其特征在于：所述MLPA長(zhǎng)探針的制備方法包括，采用引物對(duì)以PUC18質(zhì)粒為模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即MLPA長(zhǎng)探針；所述引物對(duì)由非限定引物和限定引物組成，所述非限定引物的5’端帶有磷酸化修飾；

所述非限定引物含有Seq?ID?No.7所示序列，所述限定引物含有Seq?ID?No.8所示序列；

或者所述非限定引物含有Seq?ID?No.9所示序列，所述限定引物含有Seq?IDNo.10所示序列。

7.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA短探針，其特征在于：所述短探針從5’端到3’端依次包括P1和T1區(qū)段；所述P1含有Seq?ID?No.16所示序列，所述T1含有Seq?ID?No.17或者Seq?ID?No.18所示序列。

8.一種轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測(cè)方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法包括采用權(quán)利要求5或6的MLPA長(zhǎng)探針與權(quán)利要求7的短探針以轉(zhuǎn)基因玉米品系的DNA序列為模板進(jìn)行雜交。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于：還包括采用一對(duì)通用引物對(duì)雜交后連接起來(lái)的長(zhǎng)探針和短探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述通用引物的上游/下游引物分別含有Seq?ID?No.16和Seq?ID?No.1所示序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測(cè)方法，其特征在于：還包括采用對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因進(jìn)行MLPA檢測(cè)的兩條探針，所述兩條探針分別含有Seq?IDNo.21和Seq?ID?No.22所示序列，Seq?ID?No.22所示序列探針的5’端帶有磷酸化修飾。