[發明專利]MLPA長探針制備方法、轉基因玉米MLPA長探針及檢測方法

有效

• 申請號: 201110331075.4
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN102399873A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 凌杏園;陳枝楠;章桂明;康林;向才玉;潘廣;陳菲
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術領域

本發明涉及核酸分子檢測領域，特別是涉及一種用于MLPA檢測技術的長探針的制備方法，由此方法制備的用于轉基因玉米MLPA檢測的長探針，以及轉基因玉米的MLPA檢測。

背景技術

目前基因檢測以PCR技術為主，檢測快速、靈敏度高、結果準確、可靠。然而，PCR方法單管只分析一個基因，效率低。當前要對如眾多轉基因品種和品系逐一篩查，工作量太大，成本高。因此，基因檢測急需一種高通量檢測方法。

常見的高通量基因檢測技術有基因芯片、多通道毛細管電泳和DHPLC分離技術等。然而，這些方法一般只能進行“單對多”的檢測(單樣品對多項目)，“多對多”方式的檢測(多樣品對多項目)能力有限，其有限高通量的發揮還取決于上機樣品所含被檢目標基因數。為一次性獲得多目標DNA片段，人們采用多重PCR法，但引物間相互干擾和引物多聚體使該技術檢測基因數目很難超過10個。

多重連接依賴探針擴增技術(Multiplex?Ligation?dependent?Primers?Amplification?MLPA)由荷蘭的Dr.Schouten?JP于2002年報道，最初應用于醫學檢測目的。其原理是針對不同的感興趣基因位點設計長度各不相同的探針對，探針對兩序列的一端具基因特異性，它們與各自目標基因區域復性后僅留一缺口，于此同時所有探針對中與目的基因不雜交的一端都接有相同的堿基序列(既通用序列)用于PCR，這樣當探針對與目標區復性并在連接酶的作用下相連而本身成為PCR模板DNA，并由一對公用引物擴增而以信號放大，由于針對不同的感興趣基因位點設計的探針對長度各不相同，經分離PCR產物大小(不須測序)便可知道是否有目標基因的存在，在并能進行相對定量分析。

MLPA技術包括探針的設計、探針和靶序列DNA進行雜交，之后通過連接、PCR擴增，產物通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳分離及數據收集等過程。具有經濟(不需昂貴設備)、特異性高(探針復性及連接酶識別)及高通量(單管可測多達40多個基因)的特點。此外，該法檢測所針對的基因目標區可短至40-50bp，特別適于DNA高度降解樣品的檢測。至今，MLPA技術已應用于很多領域，如單核苷酸多態性和基因突變檢測、基因片段缺失和重復、染色體數目異常、基因甲基化檢測及mRNA分析等等。

以上MLPA技術原理顯示，多基因位點憑其最終PCR擴增片段長度的不同而相互區別。為了能清晰分辨不同基因位點PCR擴增片段DNA，特別是在采用低分辨率的瓊脂糖凝膠電泳分析MLPA產物時，必須拉開各擴增片段的差距。因此，在單鏈探針設計和制備時必須將探針之間的大小拉開，隨著被檢測目的基因的增加，單鏈探針的長度也要增加，而單鏈長探針的制備則是難點。

單鏈探針制備最簡單的方法是采用化學合成法，但是，當單鏈探針超過100bp時，化學合成法則不合適，因為出現合成錯誤的概率大大增加，合成的產量也大大降低。為克服單鏈探針制備的困難，發明MLPA的荷蘭公司MRC-Holland開發了基于一套M13載體的單鏈探針制備方法，其原理就是將各M13載體的大小不同的無關序列或無關的模板(Unrelated?Template，UT)引入單鏈探針從而獲得長度不同的單鏈探針。該單鏈探針生物方法非常繁瑣，不僅需要基因克隆、病毒轉染、質粒提取等過程，還必須購買一套昂貴的M13載體，此外，操作M13病毒極易發生污染。為壟斷MLPA應用市場，現在荷蘭公司MRC-Holland不再出售M13載體，因此，單鏈長探針的制備急待克服。

發明內容

本發明的目的是針對上述MLPA長探針生物制備方法繁瑣的問題，提供一種簡單、無污染、高效的MLPA長探針制備方法。

本發明的另一目的是提供一種用于轉基因玉米MLPA檢測的長探針、短探針以及轉基因玉米的MLPA檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

本發明公布了一種MLPA長探針的制備方法，包括采用引物對以模板進行不對稱PCR擴增，然后用限制性內切酶處理不對稱PCR擴增產物，凝膠電泳經過酶切處理的不對稱PCR擴增產物，切膠回收不對稱PCR擴增產物中的單鏈DNA，即得到MLPA長探針；所述模板為與檢測靶標序列無關的序列，所述不對稱PCR擴增產物的序列內包括有多克隆位點，所述限制性內切酶與多克隆位點對應；所述引物對的一條引物從5’端到3’端依次包括與檢測靶標序列相匹配的區段和與所述模板相匹配的區段；所述引物對的另一條引物從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區段和與所述模板相匹配的區段。