[發明專利]一種新的shRNA表達載體及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 201110331036.4
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN102533826A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王升啟;王學軍;李英;胡偉;李丹丹;張秀娟;謝佩雯
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種新的shRNA表達載體，本載體可通過雙短鏈或者單長鏈退火的方法實現低成本、高效地shRNA克隆。

背景技術

功能缺失的表現型在尋找和驗證基因和生物功能方面關系中起著重要作用。RNAi誘發的基因沉默現象具有高效性、高特異性等特點，已廣泛應用于抗病毒、抗腫瘤、基因功能組學、細胞信號轉導通路等方法的研究。shRNA是一種非常有前景的RNA干擾技術。

傳統的shRNA克隆方法，是合成兩條序列不完全相同的寡核苷酸片段，將這兩種寡核苷酸片段在退火形成雙鏈后，插入用限制性內切酶雙酶切得到的線性化載體，從而得到環形的DNA分子，隨后將環狀DNA分子轉化大腸桿菌，通過篩選得到正確的基因克隆。上述方法一般需要每條鏈合成60堿基以上，兩條鏈需合成堿基120nt以上。

本專利中我們描述一種通過雙短鏈或者單長鏈構建shRNA的新方法及其載體，可快速、高效的實現shRNA的克隆表達，尤其是其具有低成本、高構建成功率、高抑制率的優勢，僅需合成50多個堿基即可實現shRNA的克隆，更適用于大規模shRNA的克隆篩選。

發明內容

本發明的目的在于對傳統的shRNA克隆方法進行改造，從而提供一種新型的shRNA克隆載體及其構建方法。具體說，本發明涉及通過雙短鏈或者單長鏈退火構建shRNA的新載體及其新方法。

本發明的shRNA克隆方法包括制備合適的克隆載體、雙短鏈或者單長鏈自身退火形成長雙鏈DNA并與本發明的載體進行連接得到環形DNA分子，通過轉化在大腸桿菌中進行復制擴增。其特征在于：

本發明的新載體采用PIII型H1啟動子并對其3’端進行了突變使其最后3-5個堿基均改變為T；

構建的shRNA采用具有回文序列的環序列，因此僅需合成兩條短鏈或者一條長鏈寡核苷酸片段，在退火后自身互補配對而形成長雙鏈DNA片段；

所述載體和自身退火后的DNA雙鏈均具有堿基序列相同的粘性末端，且同為5’端或3’端的突出端。

所述載體和自身退火后的DNA雙鏈長度的粘性末端突出段為1-5個堿基，所述堿基包括：A和T；

所述載體和自身退火后的DNA雙鏈能夠通過相同的粘性末端進行互補配對；

根據本發明，最后還包括將連接到環狀DNA分子及轉化到細菌，通過篩選得到正確的基因克隆。

總體來說，本發明提供的載體和shRNA克隆方法，只需要合成雙短鏈或者單長鏈寡核苷酸片段，自身退火后與改造后的載體通過相同的粘性末端連接，可以高效、方便、低成本地實現shRNA克隆。

本發明另一方面提供了一種基因治療載體，所述構建物含有本發明上述shRNA結構以及與所述shRNA結構相連的表達調控序列。

本發明所述的shRNA基因治療載體適用于人類細胞或組織、各種哺乳類動物細胞或組織以及轉基因動物。

附圖說明

為了更好的理解本發明的實質，下面將結合圖表、附圖來說明本載體及本載體的構建方法及其適用性。

圖1本發明載體pshOK-basic的示意圖

圖2基于本載體的環序列以及正義反義序列方向的優化

圖3基于本載體的兩種shRNA構建方法比較

圖4基于本載體抗LacZ基因的shRNA對LacZ的抑制效果

圖5基于本載體抗Gluc基因的shRNA對Gluc的抑制效果

具體實施方式

本發明提供了一種通過雙短鏈或者單長鏈寡核苷酸構建shRNA的新方法，可以高效、方便、低成本地實現shRNA克隆，以下通過實例對本發明做進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實例僅僅用于解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例一pshOK-basic克隆載體的構建