[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)EGFR基因突變的方法及試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110330795.9
• 申請(qǐng)日: 2011-10-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102367479A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖莉;陳琳玲;廖端芳;姬云;張佳;李凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州科貝生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)EGFR基因突變的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)是一種由原癌基因c-(erbB)-2編碼的跨膜糖蛋白。它由1186個(gè)氨基酸殘基組成，分為胞外段、跨膜段和胞內(nèi)激酶活性段。在EGF作用下，激活的EGFR可刺激腫瘤的生長(zhǎng)與進(jìn)展，包括促進(jìn)增殖、血管生成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡。臨床研究顯示，人類(lèi)許多的腫瘤都存在一定程度的EGFR高表達(dá)，并與患者的病情進(jìn)展、放化療敏感性及預(yù)后相關(guān)。EGFR已成為相關(guān)腫瘤尤其是肺癌化療研究的重要靶標(biāo)。

肺癌發(fā)病率為0.4-1/1000，占腫瘤死亡病例的1/3-1/4，目前肺癌的治療是以手術(shù)為主，其他肺癌治療措施有放射治療、化學(xué)治療、免疫治療、中醫(yī)中藥治療等。雖然化療研究使腫瘤的治療，尤其是5年生存率有了很大提高，但不同腫瘤因發(fā)病機(jī)理不同，對(duì)抗腫瘤藥反應(yīng)差異極大。抑制EGFR活性的EGFR-TK拮抗劑——吉非替尼(gefitinib，ZD1839，Iressa)可競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)催化區(qū)域上的ATP結(jié)合點(diǎn)，已被FDA批準(zhǔn)用于晚期非小細(xì)胞肺癌(nonsmall?cell?lung?cancer，NSCLC)患者經(jīng)化療后繼續(xù)惡化者的單用療法。最新研究表明，EGFR的酪氨酸激酶域的體細(xì)胞突變與NSCLC患者對(duì)吉非替尼的敏感性相關(guān)。這些突變均發(fā)生在酪氨酸激酶域的ATP結(jié)合域附近，88％表現(xiàn)為集19號(hào)外顯子的非移碼缺失突變和21號(hào)外顯子的單堿基替代突變。而對(duì)無(wú)EGFR突變的肺腺癌患者或其它類(lèi)型的肺癌患者，吉非替尼不僅無(wú)療效，還產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)已得到了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所確認(rèn)。因此，通過(guò)檢測(cè)EGFR突變，在大量遺傳異質(zhì)性樣本中篩選EGFR-TK拮抗劑有療效的患者，對(duì)肺癌的個(gè)體化臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。

目前，許多科研機(jī)構(gòu)和生物科技公司正致力于基因突變的研究，已開(kāi)發(fā)了許多有效的檢測(cè)方法，如PCR-SSCP、TGGE、DGGE等，但這些方法均不適用于涉及體細(xì)胞突變(稀有突變)的疾病的檢測(cè)。有檢測(cè)機(jī)構(gòu)推出的肺癌體細(xì)胞EGFR突變基因相關(guān)檢測(cè)方法，采用單細(xì)胞PCR與常規(guī)DNA測(cè)序相結(jié)合。然而，在技術(shù)層面上分析，因該方法需要顯微鏡下選取特定的腫瘤細(xì)胞，再對(duì)其DNA進(jìn)行分析，操作復(fù)雜，隨機(jī)性較大，且所需儀器昂貴。該方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)多、花費(fèi)大、效率較低，故難以大面積推廣應(yīng)用。

常規(guī)DNA測(cè)序，對(duì)稀有突變的分辨率不到10％(10-1)，常規(guī)PCR包括目前有學(xué)者采用TaqMan?PCR、PNA-LNA(peptide?nucleic?acid-locked?nucleic?acid)PCR及Mutant-enriched?PCR等方法應(yīng)用在EGFR的突變檢測(cè)中，對(duì)稀有突變的分辨率也不到1/1000(10-3)。因此，對(duì)于這類(lèi)EGFR基因的稀有頻率的體細(xì)胞突變雖在腫瘤發(fā)生中具有十分重要的意義，但其相應(yīng)的檢測(cè)方法卻是當(dāng)代個(gè)體化醫(yī)藥學(xué)中亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)EGFR基因突變的方法及試劑盒，通過(guò)采用一組特異性PCR引物對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)是否產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，以及條帶的大小判斷EGFR基因型，使得EGFR基因突變的檢測(cè)更快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒，包括：常規(guī)PCR組件，還包括特異性引物；所述特異性引物包括兩條正向引物和一條反向引物，其中兩條正向引物的序列分別具有SEQ?IDNo.1、SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ?ID?No.3所示核苷酸序列；所述特異性引物的核苷酸序列具體如下所示：

SEQ?ID?No.1：5’TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3’；

SEQ?ID?No.2：5’-CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3’；

SEQ?ID?No.3：5’-AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3’。

上述技術(shù)方案中，正向引物SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和反向引物序列SEQID?NO.3檢測(cè)的位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)EGFR基因19號(hào)外顯子的15nt缺失突變和18nt缺失突變，正向引物三末端第二個(gè)、第三個(gè)堿基(下劃線標(biāo)記)為硫化修飾堿基。