[發(fā)明專利]一種檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110330793.X
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN102399872A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李凱;張佳;王慶琳;肖莉;王偉大;姬云
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州科貝生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用PCR擴增檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

K-ras基因是重要的原癌基因，K-ras基因突變使ras蛋白一直處于激活狀態(tài)，刺激細胞不斷的生長或分化，最終導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。大約30％的人類腫瘤細胞中出現(xiàn)K-ras基因突變。Bosetal分析了人體腫瘤中K-ras基因點突變的發(fā)生率，胰腺癌82％，結(jié)腸癌43％，肺癌30％c，甲狀腺癌29％，膀胱、肝、腎和子宮癌10％或低于10％。Mok等報道交界瘤中，K-ras突變發(fā)生率為48％，突變分別發(fā)生于12號密碼子及13號密碼子。直結(jié)腸癌K-ras基因點突變率達40％-50％以上，且點突變幾乎皆位于12，13，61號密碼子，其中大多數(shù)點突變位于12號密碼子。Pontieri-Lewis等研究證實約50％的大腸癌組織中檢測出K-ras基因突變，其中約80％的點突變位于K-ras基因12號密碼子，另約15％發(fā)生在K-ras基因13號密碼子。K-ras基因突變的位點最常見于第12，13號密碼子，可導(dǎo)致p21-ras蛋白的生長信號的異常變化。過度的生長信號可刺激細胞生長和增殖從而導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生。2008年6月在美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上發(fā)布了最新臨床研究結(jié)果，即K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用；而K-ras野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益。同年10月，K-ras基因突變檢測被寫入最新版(2008年第3版)《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。該指南明確指出兩點，一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)，二是只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑(如西妥昔單抗和帕尼單抗)治療。國家衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010版)》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)(2010)165號)。該規(guī)范明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受愛必妥、帕尼單抗治療前，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。另外，《09年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：當(dāng)K-ras基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)進行分子靶向治療。綜上所述檢測K-ras基因突變的情況不僅僅有助于腫瘤的早期診斷及預(yù)防，也有利于腫瘤患者的臨床治療。準(zhǔn)確且迅速的診斷出K-ras基因有無12，13號密碼子突變對腫瘤的早期診斷及預(yù)后有著重要的意義。

目前，主要用于基因突變檢測的方法包括如下幾種：(1)利用單堿基變化產(chǎn)生新的或消除已有的內(nèi)切酶識別位點；(2)利用單堿基變化造成的堿基互補性對引物延伸反應(yīng)的影響；(3)利用單堿基變異對核酸分子雜交的影響；(4)利用單堿基變異對核酸分子在電場中遷移速度的影響；(5)直接測定單堿基變異。其中第一類的代表方法為限制性內(nèi)切酶酶解片段長度多態(tài)性，這一方法具有簡便、經(jīng)濟和十分可靠的特點，但這一方法的顯著弱點是僅能用于研究小部分涉及了限制性內(nèi)切酶酶解位點變化的突變，且該類方法難以直接應(yīng)用于高通量平行分析。另一類種類繁多且獲得廣泛應(yīng)用的突變檢測方法，是堿基特異引物延伸反應(yīng)，包括雙向引物延伸反應(yīng)，即應(yīng)用堿基特異性引物與常規(guī)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合、引物延伸反應(yīng)與連接酶相結(jié)合、引物延伸反應(yīng)與雜交分析相結(jié)合等。所有這些方法的共同點是使用了無校正功能的DNA聚合酶。上述不同方法所得的假陰性高低各不相同，但其共用的無校正功能的低保真聚合酶使所有這一類方法具有其結(jié)構(gòu)上的缺陷，即無可避免地產(chǎn)生較高的假陽性。而目前常規(guī)使用的Sanger酶法測序即雙脫氧核苷酸介導(dǎo)的單堿基延伸反應(yīng)，對突變含量較低的相嵌體、突變較少的線粒體異質(zhì)體、體細胞突變和頻態(tài)分布較低的DNA池分析均難以應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒，通過采用一組特異性PCR引物對待測樣本進行擴增，檢測是否產(chǎn)生擴增產(chǎn)物條帶，以及條帶的大小判斷K-ras基因型，可快速、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟地判斷待測樣本是否存在K-ras基因的3個熱點突變：12號密碼子GGT-GAT，GGT-GTT，13號密碼子GGC-GAC。

為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括：常規(guī)PCR組件，還包括特異性引物；所述特異性引物包括三條正向引物和一條反向引物，其中三條正向引物的序列分別具有SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ?ID?No.4所示核苷酸序列；所述特異性引物的核苷酸序列具體如下所示：