[發明專利]一種檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110330793.X
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN102399872A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 李凱;張佳;王慶琳;肖莉;王偉大;姬云
• 申請（專利權）人: 蘇州科貝生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

1.一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括：常規PCR組件，其特征在于，還包括特異性引物；所述特異性引物包括三條正向引物和一條反向引物，并且每一條正向引物的三末端第二個堿基為硫化修飾堿基；其中三條正向引物的序列分別具有SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ?ID?No.4所示核苷酸序列；所述特異性引物的核苷酸序列具體如下所示：

SEQ?ID?No.1：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3’；

SEQ?ID?No.2：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3’；

SEQ?ID?No.3：5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3’；

SEQ?ID?No.4：5’-TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’；

所述常規PCR組件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，dNTPs。

2.根據權利要求1所述檢測K-ras基因突變的試劑盒，其特征在于，所述檢測K-ras基因突變的試劑盒還包括三個檢測位點的陽性對照突變質粒，所述三個檢測位點的陽性對照突變質粒分別為：pGEM-T質粒載體插入包含K-ras基因12號密碼子GGT-GAT的突變序列，pGEM-T質粒載體插入包含K-ras基因12號密碼子GGT-GTT的突變序列，pGEM-T質粒載體插入包含K-ras基因13號密碼子GGC-GAC的突變序列。

3.采用權利要求1所述檢測K-ras基因突變的試劑盒檢測待測樣本是否存在K-ras基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)采用常規方法提取待測組織樣本基因組DNA或外周血游離DNA；

(2)以步驟(1)所得樣本基因組DNA或外周血游離DNA為模板，采用特異性引物進行多重PCR擴增，根據PCR擴增的結果判斷樣本中是否含有K-ras基因的3個熱點突變中的至少一種；判斷規則為：如果出現擴增產物，則表明樣本中含有上述3個熱點突變中的至少一種；如果沒有出現擴增產物，則表明樣本中不含上述3個熱點突變中的任意一種；所述3個熱點突變為：12號密碼子GGT-GAT突變，12號密碼子GGT-GTT突變，13號密碼子GGC-GAC突變。

4.根據權利要求3所述檢測K-ras基因突變的試劑盒檢測待測樣本是否存在K-ras基因突變的方法，其特征在于，進行多重PCR擴增時，每25μL的多重PCR擴增體系包括：1μL模板，2.5μL?10×含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，1.5μL反向引物，三條正向引物各0.5μL，0.2μL?Pfu酶，0.4μL?dNTPs，剩下加水補足；多重PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘，95℃變性20秒，68℃退火20秒，退火溫度每個循環遞減1℃，72℃延伸30秒，共10個循環；95℃變性20秒，59℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35個循環，最后72℃延伸10分鐘。

5.如SEQ?ID?No.1所述的核苷酸序列。

6.如SEQ?ID?No.2所述的核苷酸序列。

7.如SEQ?ID?No.3所述的核苷酸序列。

8.如SEQ?ID?No.4所述的核苷酸序列。