[發明專利]檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑

有效

• 申請號: 201110330608.7
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN102608081A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 朱毅;劉燕;何金龍;李楠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑，具體地涉及一種用于檢測可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，該試劑通過熒光檢測可以測定細胞或組織中可溶性表氧化物水解酶活性。

背景技術

可溶性表氧化物水解酶(Soluble?epoxide?hydrolase，sEH，又稱EPXH2)廣泛存在于哺乳動物中，在肝臟、腎臟、肺、心臟、腦、脾臟、血管內皮和平滑肌等多個組織器官中都有分布；sEH蛋白是由兩個大小為62kD的單體組成的同源二聚體，每個單體的N端和C端具有不同的酶活性，N端具有磷酸酶活性，C端具有表氧化物水解酶的活性，可以水解表氧化脂肪酸或其它表氧化物，將其轉化為相應二醇，從而降低表氧化物的化學反應性，增加其水溶性，改變它們的生物活性(Newman?JW，Prog?Lipid?Res，2005；44：1-5)。sEH的C端活性在多種疾病過程中發揮著關鍵的調節作用，抑制其活性可以降低血管緊張素2所導致的高血壓(Imig?JD，Hypertension，2002；39：690-94)、心肌肥大(Ai?D，Proc?Natl?Acad?Sci?USA，2009；106：564-69)、動脈粥樣硬化(Ulu?A，J?Cardiovasc?Pharmacol，2008；52：314-23)等，因而測定細胞及組織中的sEH活性對于相關疾病的研究及藥物的開發具有至關重要的作用。

目前測定sEHC端活性的方法主要有以下幾種：通過LC/MS/MS或ELISA的方法檢測體液、尿液、血液、細胞裂解液或上清及組織勻漿中的sEH內源性底物EETs與產物DHETs的比例來反映sEH的活性(Nithipatikom?K，Analytical?Biochemistry，2001；298，327-336，Newman?JW，Prog?Lipid?Res，2002；43，1563-78)；或將細胞裂解液與EETs或放射性標記的sEH底物孵育，檢測產物生成量從而測定sEH的活性(Liu?Y，Proc?Natl?Acad?Sci?USA，2005；102，16747-52，Ai?D，Proc?Natl?Acad?Sci?USA，2009；106：564-69)。這些方法中EETs及DHETs不穩定，極易氧化和降解且含量較低，對于實驗條件和儀器設備要求高，而使用放射性物質，易造成污染或對人體傷害，因而限制了其應用。

Nicola?M.Wolf等人報道可以使用PHOME等化合物作為sEH的底物，高通量地評估sEH抑制劑的效果(WolfNM，Analytical?Biochemistry，2006；355：71-80)。這類化合物被sEH作用后的產物可以被激發出熒光，而化合物本身并不能被激發熒光，但此方法只被用于體外檢測重組純化sEH的活性。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑。

本發明的又一目的在于提供一種制備上述試劑的方法。

為實現上述目的，本發明提供的檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，由裂解液、檢測緩沖溶液、檢測底物溶液和sEH抑制劑溶液組成；通過下述方法制備得到：

裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中：

低滲溶液可以采用去離子水，也可以是如下配制的低滲溶液：

將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7.0-7.5，水定容至100ml；

本發明優選的低滲溶液是去離子水。

苯甲基磺酰氟溶液：將苯甲基磺酰氟溶于異丙醇中，濃度為100mM；

苯甲基磺酰氟溶液與低滲溶液的體積比為1/1000～1/100；

檢測緩沖溶液：將三羥甲基氨基甲烷溶解至水中，濃度為50mM，調節pH至6.8-7.3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量為0.1-0.3mg/ml；

檢測底物溶液：將Epoxy?Fluor?7溶解至二甲基亞砜中配成5mM的溶液；

sEH抑制劑溶液：將sEH抑制劑溶解至二甲基亞砜中，配成10mM的溶液。

本發明提供的制備上述試劑的方法，其主要包括：

1)制備裂解液，所述裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液：

低滲溶液可以采用去離子水，也可以是如下配制的低滲溶液：