[發(fā)明專利]一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110330257.X
• 申請(qǐng)日: 2011-10-26
• 公開（公告）號(hào): CN102358906A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 查向東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東希普生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，具體的說是，將目標(biāo)DNA片段用平末端隨機(jī) 連接，隨后用限制性內(nèi)切酶切割，回收特定片段，與載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒；屬于基因工程 領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基因工程中最基本的技術(shù)之一是構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要目的基因整合到載體質(zhì)粒。而出于 提高表達(dá)效率、獲得分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、方便分離純化等種種原因，在整合到載體質(zhì)粒 之前，常常需要將目的基因與特定融合頭(fusion?partner)或信號(hào)肽連接、或?qū)⑿∑蜠NA拼 接成完整的目的基因、或不同外源基因串聯(lián)等，都涉及到DNA片段的拼接技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室連接不同DNA片段的常用方法當(dāng)然是DNA連接酶催化連接。DNA酶促連接有 粘性末端連接和平末端連接兩種。大腸桿菌DAN連接酶催化粘性末端的效率較高，而T4?DNA 連接酶對(duì)于平頭末端和粘性末端都能高效連接，所以在實(shí)驗(yàn)室得到更多的使用。平末端連接 產(chǎn)生的主要問題，其一是連接的非定向性，即DNA片段以不同的方向連接，僅從連接形成 的片段大小無法區(qū)分方向；其二是底物的濃度難以把握，濃度過低影響連接效率，濃度稍高 則極易形成自連和多拷貝重復(fù)連接。若使用粘性末端連接，則要求兩個(gè)DNA片段必須具有 互補(bǔ)的粘性末端，但大多數(shù)情況下在有關(guān)DNA片段之間不存在或者不允許引入限制性酶切 位點(diǎn)。

如果兩個(gè)待拼接的DNA片段較短，也可以采取從頭合成的方式直接得到；但如果兩個(gè) 待拼接的DNA片段較長時(shí)，目前常采用重疊PCR的方法來獲取目的融合片段，例如當(dāng)需要 序列已知、卻無現(xiàn)成模板的較長的目的基因，通常采用此法。該方法的缺點(diǎn)在于需要設(shè)計(jì)合 成多個(gè)引物和較長的重疊區(qū)序列，然后還要進(jìn)行多次PCR，有時(shí)因?yàn)橥嘶饻囟鹊牟町惤o實(shí)驗(yàn) 帶來不便，或者重疊區(qū)的前后兩段乃至重疊區(qū)自身有可能形成一定的空間結(jié)構(gòu)，增加了出現(xiàn) 錯(cuò)誤的幾率，且較耗費(fèi)時(shí)間。

特別是在實(shí)際情況下，實(shí)驗(yàn)室常面臨的一個(gè)重要問題是：兩個(gè)待拼接DNA片段都有現(xiàn) 成的雙鏈模板，如何利用這一優(yōu)勢(shì)高效率地把他們拼接起來？例如欲將某一目的基因分別與 不同的信號(hào)肽編碼序列拼接以比較分泌效果，將某一目的基因分別與不同融合頭基因拼接以 比較表達(dá)產(chǎn)量，等等。對(duì)此問題上述方法皆有缺陷，且尚未見報(bào)道其它有效的解決途徑。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題，本發(fā)明公開一種利用平末端隨機(jī)連接和限制性內(nèi)切酶切割，有效、快捷 的拼接DNA片段構(gòu)建重組質(zhì)粒的的簡便方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于，依次包括下述步 驟：1)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)至少兩個(gè)DNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到對(duì)應(yīng)的末端帶限制性內(nèi)切 酶識(shí)別和切割位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物；2)采用連接酶對(duì)步驟1)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行平末端連接； 3)將步驟2)所得的連接產(chǎn)物雙酶切，檢測(cè)，回收獲取目的片段；4)將步驟3)所得的目的 片段與雙酶切后的載體質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒。

上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用的酶為Pfu?DNA聚合酶或 其它擴(kuò)增結(jié)果為平末端的高溫DNA聚合酶。

上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，所述的檢測(cè)是采用0.5～1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)。

上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，步驟2)所述的連接酶為T4?DNA連接酶；

進(jìn)一步的，上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，對(duì)步驟2)獲得連接產(chǎn)物可進(jìn)一步用Pfu? DNA聚合酶進(jìn)行PCR強(qiáng)化擴(kuò)增。

上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，步驟3)所述的雙酶為Nco?I和EcoR?I或其它限制性 內(nèi)切酶。

上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，步驟3)所述的載體質(zhì)粒線性化的載體質(zhì)粒。

進(jìn)一步的，上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，步驟2)所述的目的片段是用瓊脂糖凝膠 電泳分離水解產(chǎn)物，回收大小相同的目標(biāo)片段。

進(jìn)一步的，上述的一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，步驟3)是將所得的目的片段與雙酶切后 的線性化的載體質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒。

本發(fā)明所依據(jù)的原理：