[發明專利]一種產葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其應用

有效

• 申請號: 201110329425.3
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN102382773A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 陳堅;顧磊;張娟;堵國成;沈伊娜;費麗杰;劉瑋
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/32;C12Q1/04;C12N9/04;C12R1/685
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種產葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其應用，屬于微生物技術領域。?

背景技術

葡萄糖氧化酶(Glucose?Oxidase，簡稱GOD，E.C.1.1.3.4)是一種黃素糖蛋白。葡萄糖氧化酶分子為二聚體，含有兩個亞基，分子量約160kDa，每亞基結合一個FAD分子，因此每個酶分子含有兩個FAD分子。它是一種需氧脫氫酶，以氧為電子接受體，能專一地氧化β-D-葡萄糖為葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性和高效性的優點，在食品、化工、醫藥、農業、飼料等領域有比較廣泛的應用。由于葡萄糖氧化酶良好的應用效果，目前已經在很多行業中得到了廣泛應用，近年來倍受關注，市場需求量也越來越大。?

發明內容

本發明提供了一種用于葡萄糖氧化酶生產的黑曲霉，該菌株于2011年8月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大學，保藏編號：CCTCC?NO：M2011291，分類學命名：黑曲霉BBE11721(Aspergillus?niger?BBE11721)。?

上述黑曲霉的篩選方法，包括如下步驟?

1)定性篩選：采用Fiedure.K.J顯色法，將分離出黑曲霉菌株點種于平板分離培養基，28℃培養3～4d后直至出現藍色顏色圈，進行藍色圈大小定性比對。所述平板分離培養基組成如下：葡萄糖40g?L^-1，蛋白胨2g?L^-1，，氯化鉀0.5g?L^-1，碳酸鈣3.5g?L^-1，可溶性淀粉10g?L^-1，KI?1.7g?L^-1，脫氧膽酸鈉0.2g?L^-1，瓊脂20g?L^-1，磷酸緩沖液0.1mol?L^-1，pH?5.6；?

2)定量篩選：將黑曲霉菌絲體破壁上清液中加入2.5mL鄰聯茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90Um?L^-1辣根過氧化物酶，35℃保溫2min后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0.1mL，反應3min后，加入2mol?L^-1硫酸終止反應，取出試管，測OD540的吸光值，以熱失活的酶液做空白對照。根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。?

所述1mol?L^-1磷酸緩沖液(pH6.0)：將132mL的1mol?L^-1磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)和868ml的1mol?L^-1磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)混合，調整pH值到6.0，過濾滅菌，常溫保存。?

所述鄰聯茴香胺溶液：0.1g鄰聯茴香胺，溶于10mL甲醇，為儲存液，4℃保存，實驗前取0.1ml儲存液，溶于12mL的0.1mol?L^-1，pH?6.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：0.2mol?L^-1磷酸氫二鈉溶液330.5mL與0.1mol?L^-1檸檬酸緩沖液169.5mL混合，調整pH值到6.2，去離子水定容至1L，常溫保存。?

經定性定量篩選后，獲得一株黑曲霉BBE11721，發酵96小時后葡萄糖氧化酶活可達2.2?UmL^-1，對酶的熱穩定性進行了分析，將酶液分別置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，每隔10分鐘取樣測定酶活。40℃與45℃下，60分鐘酶活沒有下降。50℃與55℃下，30分鐘降到原有酶活的80％，60分鐘降到60％。60℃下，30分鐘降到降到原有酶活的65％，60分鐘降到50％。?

本發明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶產量高的優點，經優化搖瓶產量可達4.6U?mL^-1；該菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受較高溫度，粗酶液40℃、45℃條件下，60分鐘酶活沒有損失，60℃條件下30分鐘降到降到原有酶活的65％，60分鐘降到50％。?

附圖說明

圖1：葡萄糖氧化酶活標準曲線?

圖2：黑曲霉BBE11721的系統發育樹?

圖3：采用所篩菌株在平板分離培養基上的顯色效果圖?

圖4：黑曲霉BBE11721發酵過程曲線?

圖5：40℃水浴中黑曲霉BBE11721產葡萄糖氧化酶的熱穩定性?