[發(fā)明專利]一種用于檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110328422.8
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN102329885A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設計）人: 李艷;童永清
• 申請（專利權）人: 李艷;童永清
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用基因測序技術檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性，進而指導華法林選擇用藥劑量的試劑盒。

背景技術

華法林是屬于香豆素類藥，通過抑制維生素K依賴性凝血因子的合成，延長凝血酶原活化時間，達到抗凝的目的。它在臨床上常用于治療血栓性疾病，具有抗凝和溶栓的雙重作用，是目前國際上最常用的長效抗凝劑，也是治療和預防靜脈血栓性疾病的主要藥物之一。但華法林的有效血藥濃度范圍狹窄，劑量偏小會降低治療血栓形成的效果，劑量偏大則會增大出血的風險，甚至引發(fā)大出血等副作用。

臨床上常以凝血酶原時間(PT)及國際標準化比率(INR)作為監(jiān)測指標，以達到安全有效地使用它。因此臨床醫(yī)生常先給予一定標準劑量，然后根據(jù)每個患者INR值的情況，增加或減少劑量直至INR達到靶標，從而確定需要的維持劑量，長時間的進行維持治療。使用華法林的另一個特點是其穩(wěn)定劑量在不同種族間及個體間存在著較大差異，不同個體間穩(wěn)定劑量的差異可達20倍以上。因此，將不同患者的華法林劑量調整到既安全又有效的范圍，是長期以來臨床用藥上一個非常棘手的問題。

造成華法林用量個體差異的原因很多，可分為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要有年齡、身高、體重，藥物的相互作用，飲食習慣，疾病狀態(tài)等。然而，非遺傳因素的影響程度較為有限，并非華法林用量個體差異的主要原因。近年的研究表明，遺傳因素在華法林用量個體差異的表現(xiàn)中起到關鍵的作用。影響華法林用量個體差異的遺傳因素是指與華法林的藥動學和藥效學有關的蛋白或酶的基因發(fā)生變異，影響蛋白的表達或酶的活性，從而增強或降低華法林的療效，使不同個體間的用量產(chǎn)生差異。目前，已知與華法林的藥效學和藥動學相關的基因達30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1基因(VKORC1)和細胞色素2C9(CYP2C9)的多態(tài)性是影響華法林用量個體差異最主要的兩個遺傳因素。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的CYP2C9等位基因有30余種，其中以*l(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最為常見，而VKORC1主要表現(xiàn)為G-1639A位點多態(tài)性。目前，研究人員更傾向于將遺傳因素與非遺傳因素相結合，建立新的華法林穩(wěn)定劑量預測算法，提高了劑量預測的效能。大多數(shù)這樣的算法可解釋華法林用量個體差異50%以上的原因。研究顯示VKORC1和CYP2C9的多態(tài)性對華法林用量個體差異的貢獻比例分別6-37%和5-22%。

因此，通過對患者的基因進行檢測，來確定華法林需求的維持劑量，就可以實現(xiàn)個體化用藥，既可避免劑量不夠造成血栓，又可防止劑量過大引起出血并發(fā)癥。采用敏感性及特異性均較高的基因測序法檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性，可為臨床提高華法林應用的安全性和有效性提供一種全新的快速簡便的基因診斷技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種特異的檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，為臨床個體化使用華法林劑量提供依據(jù)。

本發(fā)明的試劑盒利用基因測序技術，設計了VKORC1和CYP2C9基因PCR擴增引物，為此，本發(fā)明首先提供一種用于VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性檢測的引物：

1）VKORC1第3外顯子基因

上游引物序列為：5′-?CAGTGCCTGAAGCCCACA?-3?′，

下游引物序列為：?5′-?CTCACATGCCAAAGCAAAGC?-3?′?；

2）CYP2C9第3外顯子基因

上游引物序列為：5′-?GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG?-3’，

下游引物序列為：5′-?ATATTCACCCCAAGGCTGTCT?-3’；

3）CYP2C9第7外顯子基因

上游引物序列為：5′-?GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC?-3’，

下游引物序列為：5′-?AATGTCACAGGTCACTGCATG?-3’。

進一步本發(fā)明提供一種利用基因測序技術檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，其包括上述VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性擴增引物。基于此，本發(fā)明可以采用現(xiàn)有常規(guī)方法提取人外周血基因組、進行PCR擴增、并測序。優(yōu)選本發(fā)明試劑盒進一步包括以下試劑中的一種或多種：人外周血基因組提取試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應液和PCR測序試劑。

其中人外周血基因組提取試劑包括：去離子水，6M?NaI，氯仿/異戊醇(24：1)混合液，異丙醇和無水乙醇。