[發(fā)明專利]革蘭氏陰性菌滅活疫苗、其制備方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110327696.5
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102382872A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白同臣;曲海波;孟福強(qiáng);趙輝;王華
• 申請（專利權(quán)）人: 哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;A61K39/108;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生毒素的抗生素，尤其涉及氨芐青霉素鈉在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素中的應(yīng)用，還涉及由此制備得到的滅活疫苗及其制備方法，更涉及一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域。

背景技術(shù)

常規(guī)疫苗在生產(chǎn)過程中其抗原的主要來源為菌體抗原，因此菌體用量大且副反應(yīng)發(fā)生率高，但免疫保護(hù)率不高。研究發(fā)現(xiàn)，疫苗中含有一定的類毒素抗原，能夠與菌體抗原協(xié)同作用能較好地提高疫苗免疫效果。

類志賀變異體二型毒素是革蘭氏陰性菌培養(yǎng)中產(chǎn)生一種外毒素，主要存在于培養(yǎng)基中和細(xì)胞外膜內(nèi)，是一種蛋白毒素，是該細(xì)菌的主要毒力因子之一，戊二醛能將其完全脫毒，變成類毒素，因而具有較好的免疫原性。

氨芐青霉素鈉別名：氨芐西林鈉；氨芐青霉素；安比西林鈉；氨芐青。為廣譜半合成青霉素，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明該抗生素具有刺激細(xì)菌產(chǎn)生毒素的作用。戊二醛，帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，溶于熱水。對細(xì)菌有較好的殺滅作用，對該毒素均有較好脫毒作用，將毒素變?yōu)轭惗舅?/p>

本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。臨床選取具有產(chǎn)毒素基因的標(biāo)準(zhǔn)菌株，培養(yǎng)中培養(yǎng)基中加適量氨芐青霉素，使其大量產(chǎn)生水腫毒素，經(jīng)戊二醛溶液滅活脫毒制備疫苗，疫苗較常規(guī)疫苗除菌體抗原外，還含有一定的類毒素抗原。疫苗分別免疫免疫小鼠和仔豬，評價其免疫原性及安全性。試驗(yàn)表明，該疫苗可有效預(yù)防豬水腫病的發(fā)生，安全性和免疫原性可靠，免疫保護(hù)率達(dá)80％以上。高疫苗安全性和免疫效力如何？迄今為止，尚沒有任何文獻(xiàn)對此進(jìn)行披露。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明氨芐青霉素鈉具有刺激細(xì)菌產(chǎn)生毒素的作用，尤其是能夠誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素，因此本發(fā)明的目的之一是提供氨芐青霉素鈉在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了氨芐青霉素鈉在制備革蘭氏陰性菌滅活疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二是提供一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗的制備方法，本發(fā)明的一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于將單株或多株革蘭氏陰性菌分別接種于含氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液，菌液經(jīng)滅活后制備成單價或多價滅活疫苗，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中含有的氨芐青霉素鈉的濃度為5μg/ml。

本發(fā)明所述的方法，其特征在于具體的，包括以下步驟：

(1)一級菌種繁殖

將單株或多株凍干革蘭氏陰性菌菌種分別接種營養(yǎng)肉湯，36～37℃培養(yǎng)16-20小時后，用劃線分別接種于麥康凱瓊脂平板，置36～37℃培養(yǎng)16～20小時，在低倍鏡下，分別選取菌落5-10個混合接種于營養(yǎng)肉湯，然后分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置36～37℃培養(yǎng)16～20小時，用營養(yǎng)肉湯分別洗下菌種加10％(w/w)甘油，-20℃保存，使用期不超過6個月或斜面培養(yǎng)物置2～8℃保存，不超過1個月，純粹檢驗(yàn)合格，作為一級種子；

(2)二級菌種繁殖

取一級種子分別接種于營養(yǎng)肉湯，置36～37℃震蕩培養(yǎng)16～20小時，取樣作純粹檢查，純粹檢查合格后，置2～8℃保存；

(3)菌液培養(yǎng)

用玻瓶或生物發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，將二級菌種分別接種于含5μg/ml氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)16～18h，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液；

(4)菌液滅活

得到的菌液以總量0.4％(w/w)加入戊二醛溶液，經(jīng)37℃滅活48小時；所述的菌液為一種革蘭氏陰性菌菌液或多種革蘭氏陰性菌菌液的混合物，按活菌計數(shù)，將各菌株菌液按1∶1∶1比例混合；

(5)疫苗的制備

在檢驗(yàn)合格的滅活菌液中加入終濃度為20％(w/w)的氫氧化鋁凝膠和0.005％(w/w)的硫柳汞防腐，制備濃縮滅活疫苗，按滅活前活菌數(shù)計算，制備濃縮滅活疫苗含單株菌數(shù)均不低于100×10⁸CFU/ml。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。

本發(fā)明的目的之三是提供由以上任一所述的方法制備得到的革蘭氏陰性菌滅活疫苗。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的疫苗為仔豬水腫病滅活疫苗，更優(yōu)選的所述的疫苗為仔豬水腫病多價滅活疫苗。

本發(fā)明的目的之四是提供所述的滅活疫苗在制備治療由感染革蘭氏陰性菌引起的疾病藥物中的應(yīng)用。及

所述的滅活疫苗在制備治療豬水腫病藥物中的應(yīng)用。