[發明專利]產脂肪酶基因工程菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201110327510.6
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102505001A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 趙凱
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/55;C12N15/63;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術領域

本發明涉及一株產脂肪酶基因工程菌株及其構建方法。

背景技術

脂肪酶lipase是一種特殊的酯鍵水解酶，它能分解生物所產生的各種天然的油和脂肪，主要水解由甘油和十二碳原子以上的不溶性長鏈脂肪酸形成的甘油三酯；同時，還可以催化甘油三酯與低碳醇的酯交換反應。由于脂肪酶的這種催化特性，使其可以應用在生物柴油的生產中。

生物柴油是近年來開始研究的一種性質類似于柴油的可再生的新型生物質能。生物柴油主要以植物油、動物油和廢棄食用油為原料，生產方法可以分為直接混合使用、微乳化法、熱解法和酯交換法。脂肪酶可以應用在催化酯交換反應中，這種催化反應的反應條件溫和，副產品分離較簡單，不污染環境。但是，目前，使用的脂肪酶大多數都是進口的，價格昂貴，導致生物柴油價格偏貴，不利于生物柴油的產業化生產和推廣使用。

發明內容

本發明是要解決現有脂肪酶大多數都是進口的，價格昂貴，導致生物柴油價格偏貴的問題，提供產脂肪酶基因工程菌株及其構建方法。

本發明產脂肪酶基因工程菌株的細胞呈橢圓形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面光滑、濕潤；產脂肪酶酶活高。

上述產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行：一、產脂肪酶菌株解脂耶羅維亞酵母HDY-76基因組DNA的提取：取3mL解脂耶羅維亞酵母HDY-76的菌液，于12000r/min離心1min，棄去上清，按TIANGEN公司的基因組DNA提取試劑盒提取解脂耶羅維亞酵母HDY-76基因組DNA；二、lip7基因的PCR擴增：以步驟一提取到的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得擴增產物，將擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測；將擴增產物采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因lip7，將目的基因lip7進行測序驗證其準確性；三、重組表達載體pGAPHαM-lip7的構建：將目的基因lip7用Xho?I和Not?I進行雙酶切，將表達載體pGAPHαM用Xho?I和Not?I進行雙酶切，酶切后純化回收目的基因lip7與表達載體pGAPHαM，用T₄DNA連接酶于4℃連接10～14h，得到重組載體pGAPHαM-lip7；四、產脂肪酶基因工程菌株構建：用限制性內切酶BglII對重組載體pGAPHαM-lip7進行酶切，酶切后回收重組載體pGAPHαM-lip7，將酶切后的重組載體pGAPHαM-lip7與畢赤酵母感受態細胞GS115混合進行電擊轉化，然后將菌液涂布于MD固體培養基上，28℃恒溫培養至長出菌落，隨機挑取MD固體培養基上的單菌落，接種于5mL?YPD培養基中，28℃震蕩培養72h，然后于5000r/min離心5min，取上清測定酶活，有酶活力的單菌落為陽性轉化子，即完成產脂肪酶基因工程菌株的構建；其中步驟一中解脂耶羅維亞酵母HDY-76的菌液濃度為10⁶～10⁷cfu/mL；步驟二中PCR擴增的正向引物為5′-ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG-3′，反向引物為5′-AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC-3′。

本發明的有益效果：

本發明構建的產脂肪酶工程菌株生物發酵產生的脂肪酶酶活為322.91～335.95U/mL，比初始菌株脂肪酶酶活151.73～159.47U/mL有顯著的提高。

目前，工業用脂肪酶大多數都是進口的，價格昂貴，嚴重限制了其推廣應用。本發明利用基因重組技術構建脂肪酶高產工程菌株，為將其應用在酶法催化油脂生產生物柴油中奠定了基礎，可降低生物柴油的生產成本，為產業化生產和推廣使用生物柴油提供了新思路。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式產脂肪酶基因工程菌株的細胞呈橢圓形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面光滑、濕潤；產脂肪酶酶活高。