[發明專利]產脂肪酶基因工程菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201110327510.6
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102505001A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 趙凱
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/55;C12N15/63;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

1.產脂肪酶基因工程菌株，其特征在于產脂肪酶基因工程菌株的細胞呈橢圓形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面光滑、濕潤；產脂肪酶酶活高。

2.權利要求1所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行：一、產脂肪酶菌株解脂耶羅維亞酵母HDY-76基因組DNA的提取：取3mL解脂耶羅維亞酵母HDY-76的菌液，于12000r/min離心1min，棄去上清，按TIANGEN公司的基因組DNA提取試劑盒提取解脂耶羅維亞酵母HDY-76基因組DNA；二、lip7基因的PCR擴增：以步驟一提取到的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得擴增產物，將擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測；將擴增產物采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因lip7，將目的基因lip7進行測序驗證其準確性；三、重組表達載體pGAPHαM-lip7的構建：將目的基因lip7用Xho?I和Not?I進行雙酶切，將表達載體pGAPHαM用Xho?I和Not?I進行雙酶切，酶切后純化回收目的基因lip7與表達載體pGAPHαM，用T₄?DNA連接酶于4℃連接10～14h，得到重組載體pGAPHαM-lip7；四、產脂肪酶基因工程菌株構建：用限制性內切酶BglII對重組載體pGAPHαM-lip7進行酶切，酶切后回收重組載體pGAPHαM-lip7，將酶切后的重組載體pGAPHαM-lip7與畢赤酵母感受態細胞GS115混合進行電擊轉化，然后將菌液涂布于MD固體培養基上，28℃恒溫培養至長出菌落，隨機挑取MD固體培養基上的單菌落，接種于5mLYPD培養基中，28℃震蕩培養72h，然后于5000r/min離心5min，取上清測定酶活，有酶活力的單菌落為陽性轉化子，即完成產脂肪酶基因工程菌株的構建；其中步驟一中解脂耶羅維亞酵母HDY-76的菌液濃度為10⁶～10⁷cfu/mL；步驟二中PCR擴增的正向引物為5′-ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG-3′，反向引物為5′-AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC-3′。

3.根據權利要求2所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應體系如下：

PCR擴增條件為：94℃預變性4min，94℃變性45s，58.5℃退火30s，72℃延伸80s，共32個循環，再72℃延伸10min，4℃保溫。

4.根據權利要求2所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中將目的基因lip7用Xho?I和Not?I進行雙酶切的體系如下：

酶切反應條件：37℃，12～14h。

5.根據權利要求2所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中將表達載體pGAPHαM用Xho?I和Not?I進行雙酶切的體系如下：

酶切反應條件：37℃，12～14h。

6.根據權利要求2所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟三中連接反應體系如下：

7.根據權利要求2所述的產脂肪酶基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟四中酶切的體系如下：

酶切反應條件：37℃，12～14h。