[發(fā)明專利]用于篩選抗血管損傷藥物的斑馬魚(yú)血管損傷模型及其建立方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110327420.7
• 申請(qǐng)日: 2011-10-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102499135A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李銘源;黎晌;許貝文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 澳門(mén)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K61/00
• 分類號(hào): A01K61/00;A61K49/00;G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 周端儀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種斑馬魚(yú)血管損傷模型的建立方法，以及將該該模型應(yīng)用于篩選抗血管損傷藥物的方法。

背景技術(shù)

血管新生(angiogenesis)，指成人在原始血管叢或已存在血管的基礎(chǔ)上以出芽的方式形成新生血管的過(guò)程，具有維持人體正常的生長(zhǎng)和平衡的功能，在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸、預(yù)后中扮演著重要的角色。近年來(lái)，調(diào)節(jié)血管新生的研究已成為臨床治療中的熱點(diǎn)。血管新生主要涉及基底膜的降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管形成等過(guò)程，其中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管新生的最主要指標(biāo)之一。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和死亡還是冠心病、中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的重要病理過(guò)程。然而由于心血管疾病引起的死亡在疾病死亡率排行版中長(zhǎng)居前三甲，因此，臨床上一直且迫切的希望發(fā)現(xiàn)一種能夠有效調(diào)節(jié)血管新生，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物。

關(guān)于血管新生方面的研究，目前已有多種體內(nèi)體外的模型。比如，體外的模型有，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化模型；相對(duì)于體外模型，體內(nèi)的模型有著更多的生理系統(tǒng)，從而可以從整體上展開(kāi)對(duì)血管新生深入的全面的研究，比如雞絨毛尿囊膜(CAM)模型，斑馬魚(yú)及轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型，小鼠的角膜血管新生模型，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠背氣囊模型等等，在上述諸多模型中，都能有效的篩選出血管新生潛在的藥物，但是隨著血管新生研究的越來(lái)越深入，以斑馬魚(yú)為模型用來(lái)研究及篩選血管新生類的藥物逐漸被人們所認(rèn)可。而斑馬魚(yú)在血管新生研究中的諸多優(yōu)勢(shì)為該類研究提供了便利，比如高產(chǎn)蛋率從而提供了充足大量的實(shí)驗(yàn)材料，斑馬魚(yú)的基因以及血管新生的調(diào)節(jié)機(jī)理與哺乳動(dòng)物大量的相同使得該模型的研究更有意義，透明的胚胎與轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Tg(fli-1：EGFP))相結(jié)合使得神秘的血管循環(huán)系統(tǒng)成為可見(jiàn)等等。

然而，目前將斑馬魚(yú)用來(lái)研究血管新生及血管新生藥物的篩選都是基于正常的斑馬魚(yú)。比如，抗血管新生藥物的篩選根據(jù)其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎時(shí)期背部節(jié)間血管(ISV)的影響來(lái)判斷的，而促血管新生的藥物的篩選主要是根據(jù)其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎時(shí)期腸下靜脈血管(SIV)的影響來(lái)判斷的。該方法的優(yōu)勢(shì)是根據(jù)血管新生的血管的特殊形態(tài)能夠直接快速的發(fā)現(xiàn)潛在的血管新生的藥物，但是美中不足的是以此方法篩選出的藥物對(duì)于血管新生類疾病的治療是不能確定的，換句話說(shuō)，在正常模型中有效的藥物不一定在病理模型中有效，因此，病理模型的藥物篩選對(duì)于藥物治療效果的要求更為直接也更有意義。然而感到遺憾的是，在斑馬魚(yú)這個(gè)優(yōu)秀的研究血管新生的模型中尚未建立一個(gè)效果顯著，穩(wěn)定及被認(rèn)可的血管的病理模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的技術(shù)的不足，提供一種斑馬魚(yú)血管損傷模型，其為病理模型，能夠模擬體內(nèi)血管新生不足的環(huán)境進(jìn)行快速篩選具有促血管新生類的藥物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述斑馬魚(yú)血管損傷模型的建立方法，其操作簡(jiǎn)單，造模成功率高。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是將上述斑馬魚(yú)血管損傷模型應(yīng)用于篩選抗血管損傷藥物的方法，其操作方便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、所需受試藥物少、成本低。

為實(shí)現(xiàn)以上的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種斑馬魚(yú)血管損傷模型的建立方法，其特征在于包括以下順序步驟：

(1)取受精后24-28小時(shí)大的轉(zhuǎn)基因或野生型的斑馬魚(yú)胚胎拆蛋殼后；

(2)加入濃度為100～600nM/L的血管生長(zhǎng)因子受體抑制劑，造模3-4小時(shí)；

(3)清洗掉血管生長(zhǎng)因子受體抑制劑，得到斑馬魚(yú)血管損傷模型。

上述方法制得的用于篩選抗血管損傷藥物的斑馬魚(yú)血管損傷模型。

一種篩選抗血管損傷藥物的方法，其特征在于包括以下順序步驟：(1)采用上述的斑馬魚(yú)血管損傷模型作為空白對(duì)照組及受試藥物組，取正常生長(zhǎng)的且生長(zhǎng)時(shí)間相同的斑馬魚(yú)胚胎為正常對(duì)照組，每組斑馬魚(yú)數(shù)量相等為5-15條；將所配好濃度的受試藥物加入到受試藥物組的水溶液(胚胎培養(yǎng)基)中，正常對(duì)照組和空白對(duì)照組則加入等量的溶媒的胚胎培養(yǎng)基；(2)給藥24，48，72小時(shí)分別用熒光顯微鏡觀察血管的形態(tài)，并且在給藥24小時(shí)檢測(cè)斑馬魚(yú)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(Flk-1A，F(xiàn)lk1-B，F(xiàn)lt1)基因表達(dá)的水平的變化。

本發(fā)明針對(duì)本領(lǐng)域無(wú)類似技術(shù)而提供了斑馬魚(yú)血管損傷模型及其建立方法，以及將斑馬魚(yú)血管損傷模型應(yīng)用于篩選抗血管損傷藥物的方法中，克服了現(xiàn)有的技術(shù)的不足，操作方便、造模成功率高、可以模擬體內(nèi)環(huán)境快速篩選、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、所需受試藥物少、成本低，應(yīng)用范圍廣泛，工作效率高。

附圖說(shuō)明