[發(fā)明專利]一種A40926的發(fā)酵工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110324632.X
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN103060405A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡海峰;陳昌發(fā);張長清;朱寶泉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;鐘華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種A40926的發(fā)酵工藝。

背景技術(shù)

達巴萬星(Dalbavancin)中間體A40926是1984年科學(xué)家在培養(yǎng)分離來自土壤的馬杜拉放線菌屬菌種(Actinomadura)時發(fā)現(xiàn)的一種糖肽類物質(zhì)。2003年將A40926的產(chǎn)生菌歸類于野野村氏菌屬放線菌ATCC?39727(Nonomuraea.sp?ATCC?39727)。A40926包括5個主要組份：PA，PB，A，B0和B1，其中B0和B1統(tǒng)稱為B組份。A40926B組份經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后可得到一種新型糖肽類抗細菌藥物達巴萬星。

達巴萬星是由Vicuron公司開發(fā)研究，目前正處于III期臨床試驗。研究發(fā)現(xiàn)達巴萬星作用機制與萬古霉素和替考拉寧相同，抑制G+菌細胞壁的生物合成，被廣泛用作治療皮膚和軟組織感染的藥物。并且，體內(nèi)、外試驗表明，達巴萬星對于G⁺菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、鏈球菌等具有抗菌活性；對耐G⁺病原菌包括耐青霉素和頭孢曲松肺炎鏈球菌、替考拉寧不敏感CoNS、非vanA型腸球菌具有活性；對G⁺厭氧菌也具有活性。目前，達巴萬星在治療導(dǎo)管相關(guān)的血源性感染以及皮膚和軟組織感染已取得了良好的效果，其優(yōu)良的體內(nèi)抗菌活性和安全性，具有更誘人的開發(fā)前景。

目前，對于A40926生產(chǎn)發(fā)酵工藝研究均較少。Technikova-Dobrova等人研究了不同培養(yǎng)基成分對野野村氏菌屬放線菌ATCC39727生長以及生產(chǎn)A40926的影響時發(fā)現(xiàn)含為L-谷氨酰胺的NM-103培養(yǎng)基A40926產(chǎn)量較高，達到了122.6ug/ml，但若要生產(chǎn)應(yīng)用，現(xiàn)有A40926產(chǎn)量很低顯然不能夠滿足要求(Appl?Microbiol?Biotechnol，2004，65：671-677)。Beltrametti等人研究發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸是A40926?B0組份的分支酰基鏈的潛在前體，在T/2培養(yǎng)基中添加0.3％L-纈氨酸，A40926總產(chǎn)量達到最高220u/ml(The?Journal?Of?Antibiotics，2004，57(1)：33-44)；但是，此方法僅限于搖瓶試驗，在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵罐上進行大規(guī)模生產(chǎn)工藝情況就不得而知了。鑒于現(xiàn)有的A40926發(fā)酵方法只是簡單的搖瓶實驗，且發(fā)酵單位低，達不到生產(chǎn)化的要求，該現(xiàn)狀亟待解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有技術(shù)中A40926的發(fā)酵工藝的發(fā)酵產(chǎn)率低，僅限于簡單搖瓶實驗，無法達到生產(chǎn)化要求的缺陷，提供了一種操作簡單、成本低、能夠大規(guī)模生產(chǎn)，最高可生產(chǎn)720mg/L達巴萬星關(guān)鍵中間體A40926的發(fā)酵工藝。

本發(fā)明的A40926的發(fā)酵工藝包括如下步驟：將產(chǎn)A40926的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)在培養(yǎng)至72h～112h，流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的溶液控制葡萄糖0.5％～1.2％，蛋白胨0.3％～0.8％，L-纈氨酸0.05％～0.12％，百分比為各成分占發(fā)酵培養(yǎng)基總量的質(zhì)量百分比。

本發(fā)明中，所述的產(chǎn)A40926的菌種為本領(lǐng)域常規(guī)所說的能夠發(fā)酵生產(chǎn)A40926的菌種，較佳的為野野村氏菌屬放線菌ATCC?39727(Nonomuraea.spATCC?39727)。

本發(fā)明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的溶液步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)較佳的培養(yǎng)至88h～104h，更佳的為96h。

本發(fā)明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的溶液步驟中，較佳的控制葡萄糖0.8％～1.0％，蛋白胨0.4％～0.6％，L-纈氨酸0.08％～0.12％。

本發(fā)明中，所述的蛋白胨為本領(lǐng)域常規(guī)使用的蛋白胨，較佳的為魚粉蛋白胨。

本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵工藝在本領(lǐng)域常規(guī)使用的培養(yǎng)容器中進行，較佳的為發(fā)酵罐，更佳的為50L不銹鋼罐。所述的葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的用量較佳的分別為發(fā)酵罐實際裝液質(zhì)量的1％，0.5％和0.1％，所述的葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的溶液總體積較佳的為發(fā)酵罐實際裝液質(zhì)量12％，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-纈氨酸的溶液的流加速率較佳的為0.8g/L.h～1.3g/L.h。