[發(fā)明專利]一種適用于吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1,5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110324523.8
• 申請(qǐng)日: 2011-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN102382875A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 商純爾;陳青松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江夸克生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/54
• 分類號(hào): C12Q1/54;C12Q1/48;C12Q1/32
• 代理公司: 杭州宇信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33231
• 代理人: 張宇娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適用于吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法和試劑盒。?

背景技術(shù)

1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)，又名2-脫氧葡萄糖、1，5-脫水山梨醇。臨床資料表明，血清1，5-AG的監(jiān)測(cè)可確切地反映較短期內(nèi)糖尿病的控制程度，是糖尿病監(jiān)護(hù)中的良好指標(biāo)。?

自1，5-脫水葡糖醇對(duì)糖尿病的診斷意義被臨床所認(rèn)識(shí)以來，已有陰離子交換層析法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)、吡喃糖氧化酶分析法等諸多方法應(yīng)用于血清1，5-AG的測(cè)定。前三種方法需要對(duì)1，5-AG進(jìn)行衍生和復(fù)雜的樣品前處理，同時(shí)需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規(guī)分析。吡喃糖氧化酶分析法雖好，但測(cè)定試劑的穩(wěn)定性普遍較差，難以在臨床推廣應(yīng)用。?

申請(qǐng)者研究發(fā)現(xiàn)，要開發(fā)穩(wěn)定的液體型血清1，5-AG吡喃糖氧化酶法測(cè)定試劑，應(yīng)重點(diǎn)建立一種快速清除高濃度葡萄糖的方法，以消除葡萄糖對(duì)1，5-AG測(cè)定的干擾。Fukumura?Y(Clin?Chem，1994，40：2013-2016.)、陳國(guó)軍(中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22(6)：358-361.)、第一化學(xué)藥品株式會(huì)社(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?7126042.7)武漢埃克瑪生物技術(shù)有限公司(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9116563.2)等在測(cè)定1，5-AG時(shí)，將葡萄糖通過酶法途徑轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，但生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足時(shí)可重新轉(zhuǎn)化為葡萄糖，即使引入ATP再生系統(tǒng)也無法避免葡萄糖對(duì)1，5-AG測(cè)定的干擾。馮景(檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005，20(6)：551-514.)等將葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與吡喃糖氧化酶反應(yīng)的6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，該酶法轉(zhuǎn)化途徑需要高濃度的三磷酸腺苷(ATP)以確保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中生成的二磷酸腺苷(ADP)對(duì)該轉(zhuǎn)化途徑存在反饋抑制，不利于高濃度的葡萄糖清除，?另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該測(cè)定試劑存儲(chǔ)過程中ATP的逐步分解直接導(dǎo)致葡萄糖清除能力的降低，從而給制備液體型穩(wěn)定試劑帶來困難。協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9124799.X)在將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖-1，6-二磷酸，同時(shí)使1，5-脫水葡糖醇轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡糖醇-6磷酸，然后再用1，5-脫水葡糖醇-6磷酸脫氫酶系對(duì)1，5-脫水葡糖醇-6磷酸進(jìn)行定量測(cè)定。由于吡喃糖氧化酶對(duì)1，5-脫水葡糖醇-6磷酸不產(chǎn)生任何氧化作用，因此該葡萄糖消除方法無法應(yīng)用于1，5-脫水葡糖醇的吡喃糖氧化酶法測(cè)定。?

本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足，建立一種適用于吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法。在測(cè)定血清1，5-AG前，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與吡喃糖氧化酶反應(yīng)的6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，并使反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK作用重新轉(zhuǎn)化為ATP，體系中僅需0.5mmol/LATP就可使60mmol/L的葡萄糖在180s內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯。依據(jù)該法構(gòu)建的葡萄糖清除試劑置2-8℃保存可穩(wěn)定14個(gè)月，可以應(yīng)用于目前廣泛使用的臨床生化自動(dòng)分析儀，從而達(dá)到大規(guī)模測(cè)定樣本的要求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1，5-脫水葡糖醇的快速清除高濃度葡萄糖的方法。?

一種適用于吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1，5-脫水葡糖醇的快速清除高濃度葡萄糖的方法，包括：配制pH6.0-9.0的2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清樣本，并于20-50℃反應(yīng)3-5分鐘。其中血清樣本和葡萄糖清除試劑的體積比控制在1/10-1/200，可以獲得很好的測(cè)試結(jié)果。在ATP存在下，GK將Glu轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同時(shí)生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD進(jìn)一步把G6P轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(G6PL)；反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK作用重新轉(zhuǎn)化為ATP。上述反應(yīng)后可加入含4-?氨基安替比林(4-AAP)、PROD、過氧化物酶(HRP)、3-羥基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)的顯色劑進(jìn)行顯色。所述顯色劑中各組分的最適含量為4-氨基安替比林(4-AAP)2mmol/L、PROD?50KU/L、過氧化物酶(HRP)6KU/L和3-羥基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)2.0mmol/L。?